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上海巴玖講解實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)
實(shí)時(shí)熒光定量PCR (real time fluorogenetic quantitative PCR, FQ-PCR)，是在PCR定性技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的核酸定量技術(shù)。它是一種在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)檢測整個(gè)PCR過程，后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。該技術(shù)不僅實(shí)現(xiàn)了對(duì)DNA模板的定量，而且具有靈敏度高、特異性和可靠性更強(qiáng)、能實(shí)現(xiàn)多重反應(yīng)、自動(dòng)化程度高、無污染性、具實(shí)時(shí)性和準(zhǔn)確性等特點(diǎn)，目前已廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)研究和醫(yī)學(xué)研究等領(lǐng)域。
在熒光定量PCR技術(shù)中，有一個(gè)很重要的概念是Ct值。C代表Cycle, t代表threshold, Ct值的含義是：每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。
研究表明，每個(gè)模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可做出標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中橫坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)，縱坐標(biāo)代表Ct值。因此，只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出該樣品的起始拷貝數(shù)。
熒光定量PCR所使用的熒光物質(zhì)可分為2種：熒光染料和熒光探針。熒光染料法是指SYBR Green I法，熒光探針法包括Taqman探針法、LightCycler法和分子信標(biāo)（Molecularbeacon）法。
SYBR Green I法是在PCR反應(yīng)體系中加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后，發(fā)射熒光信號(hào)，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會(huì)發(fā)射任何熒光信號(hào)，從而保證熒光信號(hào)的增加與PCR產(chǎn)物的增加*同步。擴(kuò)增產(chǎn)物序列特異性通過反應(yīng)后變性分析來確證。在反應(yīng)的后階段，反應(yīng)體系的溫度逐漸升高，雙鏈DNA慢慢地變成單鏈，從而SYBR Green I染料釋放出來，導(dǎo)致熒光強(qiáng)度的慢慢降低，測定整個(gè)過程的熒光強(qiáng)度，可以獲得PCR產(chǎn)物的變性溫度，因?yàn)槊恳环NPCR產(chǎn)物都有不同的長度和GC百分比，所以也具有特征性的變性溫度。通過變性曲線得到的產(chǎn)物大小可以和PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果相比較。這種方法在檢測禽肉中的沙門氏菌和干凍食品中的細(xì)菌活性方面已有報(bào)道。
Taqman探針法是利用Taq DNA聚合酶的5'→3'核酸酶活性來酶切和降解標(biāo)記報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)的探針，所以稱為Taqman探針。探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收，PCR擴(kuò)增時(shí)，Taq酶的5'→3’外切酶活性將探針酶切降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào)，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成*同步。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的指數(shù)增加和熒光強(qiáng)度的增加是相對(duì)應(yīng)的。這個(gè)系統(tǒng)現(xiàn)在已經(jīng)商品化，TagMan系統(tǒng)已經(jīng)被用來檢測食物或者純培養(yǎng)物中的單核增生李斯特氏菌、大腸埃希氏菌0157: H7和沙門氏菌。
分子信標(biāo)探針是一種具有莖和環(huán)狀結(jié)構(gòu)的單鏈核酸分子，探針分子中環(huán)狀部分的序列和靶核酸的主要已知序列互補(bǔ)，莖部是通過探針序列任何一側(cè)的2個(gè)互補(bǔ)臂序列退火形成。臂序列和靶序列沒有關(guān)系，一個(gè)熒光基團(tuán)貼附在一個(gè)臂的終端，一個(gè)非熒光基團(tuán)貼附在另一個(gè)臂的終端。莖部使得這2個(gè)基團(tuán)緊緊地貼在一起。從而使得熒光團(tuán)釋放出來的熒光被FRET淬滅。熒光團(tuán)一淬滅對(duì)的原理是熒光團(tuán)接收到的熒光轉(zhuǎn)移到淬滅物上，消散為熱而不是光，結(jié)果熒光團(tuán)不能釋放熒光。但是當(dāng)探針遇到靶分子時(shí)，形成的雜交物比通過臂序列形成的雜交物長并且穩(wěn)定，因?yàn)楹怂岬亩?jí)螺旋結(jié)構(gòu)相對(duì)堅(jiān)硬，探針和靶序列的雜交就排除了同時(shí)存在臂序列雜交的可能。這樣，探針就經(jīng)過自然結(jié)構(gòu)的改變而使臂序列分開，進(jìn)而使熒光團(tuán)和淬滅物相互分離。因?yàn)闊晒鈭F(tuán)和淬滅物不再緊密地連接在一起，所以在紫外線燈照射下能夠產(chǎn)生熒光。這種方法對(duì)致病性反轉(zhuǎn)錄病毒的檢測、沙門氏菌和大腸埃希氏菌0157的檢測都有應(yīng)用。
核酸雜交法
核酸雜交技術(shù)是分子生物學(xué)領(lǐng)域中常用的基本技術(shù)方法之一。其基本原理是：具有一定同源性的兩條核酸單鏈在一定條件下（適宜的溫度及離子強(qiáng)度等）可以按堿基互補(bǔ)原則退火形成雙鏈。此雜交過程是高度特異性的。雜交的雙方分別是待測核酸序列及探針。用于檢測的已知核酸片段稱之為探針（probe)。為了便于示蹤，探針必須用一定的手段加以標(biāo)記，以便于隨后的檢測。常用的標(biāo)記物是放射性核素、半抗原（digaoxigenin)，生物素(biotin)，辣根過氧化物酶(HRP)，還可以標(biāo)記一些熒光物質(zhì)如異硫氰酸熒光素（FITC),花青（cyanine, Cy2, Cy3, Cy5）等。
核酸雜交中經(jīng)常使用的是印跡雜交技術(shù)。印跡雜交技術(shù)是指將帶檢測的核酸分子結(jié)合到一定的固相支持物上，然后與存在于液相中標(biāo)記的核酸探針進(jìn)行雜交的過程。其操作基本流程是：首先用凝膠電泳將待測核酸片段分離，然后用印跡技術(shù)將分離的核酸片段轉(zhuǎn)移到特異的固相支持物上，轉(zhuǎn)移后的核酸片段將保持其原來的相對(duì)位置不變。再用標(biāo)記的核酸探針與固相支持物上的核酸片段進(jìn)行雜交。后洗去未雜交的游離探針分子，通過放射自顯影等檢測方法顯示標(biāo)記的探針的位置。由于探針已與待測核酸片段中的同源序列形成雜交分子，探針分子顯示的位置及其量的多少，則反映出待測核酸分子中是否存在相應(yīng)的基因序列及其量與大小。