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一、概述

1 當(dāng)前細(xì)胞培養(yǎng)和觀察的常用方法

十九世紀(jì)起，當(dāng)顯微鏡出現(xiàn)后，人們就開(kāi)始嘗試對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察，并在二十世紀(jì)發(fā)展出細(xì)胞的培養(yǎng)技術(shù)。單層細(xì)胞的培養(yǎng)相對(duì)方便，而且商業(yè)化的顯微鏡非常適合于平面的、薄樣品的觀察，所以，在二十世紀(jì)的中后期，人們普遍采用 2D 的細(xì)胞培養(yǎng)方法，進(jìn)行生物學(xué)的研究，以及進(jìn)行藥物的篩選、開(kāi)發(fā)和疾病治療的研究。

2 2D 和 3D 細(xì)胞培養(yǎng)及對(duì)細(xì)胞的影響

通常，2D 細(xì)胞培養(yǎng)不但被用來(lái)在體外研究不同類型的細(xì)胞，還被用來(lái)進(jìn)行藥物的篩選和評(píng)價(jià)等各個(gè)方面。這種單層的培養(yǎng)體系使細(xì)胞生長(zhǎng)于聚酯或玻璃的表面，同時(shí)存在的培養(yǎng)液能夠給細(xì)胞生長(zhǎng)提供養(yǎng)分。無(wú)數(shù)的生物學(xué)家通過(guò)這種方式極大地推動(dòng)了生物學(xué)和醫(yī)學(xué)進(jìn)展。

然而，其簡(jiǎn)單的操作方法也造成了這種模式無(wú)法準(zhǔn)確的描述和模擬細(xì)胞在體內(nèi)復(fù)雜的微環(huán)境和各種復(fù)雜生物學(xué)過(guò)程，如細(xì)胞信號(hào)傳遞，生化過(guò)程或幾何學(xué)改變。另外通過(guò) 2D 細(xì)胞培養(yǎng)方法獲得的數(shù)據(jù)應(yīng)用于體內(nèi)也會(huì)造成一些誤導(dǎo)和不可預(yù)測(cè)性。這些原因促使很多科學(xué)家將目標(biāo)轉(zhuǎn)向了 3D 細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，一種在體外能夠更加準(zhǔn)確描述細(xì)胞真實(shí)微環(huán)境的方法。細(xì)胞在體外三維環(huán)境下生長(zhǎng)產(chǎn)生特殊的生物物理和生物力學(xué)信號(hào)，這些都會(huì)影響到細(xì)胞的功能，如細(xì)胞遷移、細(xì)胞粘附、增殖和基因表達(dá)等 ( 如下圖 )。

我們知道，有多種不同的 3D 細(xì)胞培養(yǎng)方法，不同的方法有著各自的優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)。與 2D 培養(yǎng)不同，3D 細(xì)胞培養(yǎng)具有微小結(jié)構(gòu)的形成和復(fù)雜的環(huán)境特征，能夠促進(jìn)細(xì)胞的分化和組織形成。實(shí)際上，相比較于生長(zhǎng)于 2D 環(huán)境，在 3D 環(huán)境中細(xì)胞能夠承受更多的形態(tài)學(xué)和生理學(xué)變化。有研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞基底的成分和結(jié)構(gòu)不但能夠影響基因表達(dá)，還能增強(qiáng)細(xì)胞間聯(lián)系。如有些促進(jìn)細(xì)胞增值的基因在 3D 培養(yǎng)環(huán)境下受到抑制，從而不會(huì)像 2D 培養(yǎng)下那樣無(wú)限生長(zhǎng)。3D 細(xì)胞培養(yǎng)還會(huì)促進(jìn)共培養(yǎng)環(huán)境下的兩種不同細(xì)胞群體的生長(zhǎng)，從而能夠準(zhǔn)確重現(xiàn)組織功能。另外，3D 培養(yǎng)技術(shù)能夠使細(xì)胞微環(huán)境參數(shù) ( 溫度、化合物濃度、氧氣、pH 等 ) 易于控制和監(jiān)測(cè)。

但是 3D 細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)也有明顯的缺陷，這些缺陷還需要技術(shù)進(jìn)步來(lái)彌補(bǔ)。首先，一些基質(zhì)膠會(huì)從動(dòng)物或其他來(lái)源吸收一些有害或不需要的物質(zhì)，如病毒，可溶性因子等，會(huì)干擾細(xì)胞培養(yǎng)。有些基質(zhì)具有很好的細(xì)胞粘附性，使細(xì)胞去除過(guò)程更加困難。 另外，3D 細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是一種高性價(jià)比的技術(shù)，能夠在藥物評(píng)價(jià)階段省掉動(dòng)物藥物測(cè)試過(guò)程，整個(gè)流程可實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，可重復(fù)性好。

3 3D 細(xì)胞技術(shù)的延伸和前景

隨著 3D 細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展和成熟，大量的新的相關(guān)技術(shù)出現(xiàn)，如微流控技術(shù)、微器官技術(shù)等。這些技術(shù)使得培養(yǎng)環(huán)境的控制和監(jiān)測(cè)更加容易，同時(shí)能夠使藥物推進(jìn)臨床的速度大大加快，評(píng)價(jià)結(jié)果的可靠性也會(huì)大大增加。

二、3D 細(xì)胞球培養(yǎng)方法

根據(jù) 3D 細(xì)胞培養(yǎng)中細(xì)胞生長(zhǎng)情況，分為兩種方法，基于 Scaffold 基質(zhì)膠的 (SCAFFOLD-BASED) 3D 細(xì)胞培養(yǎng)法和無(wú)基質(zhì)(SCAFFOLD-FREE) 的 3D 細(xì)胞培養(yǎng)。

1 基質(zhì)的類型

基質(zhì)是3D細(xì)胞培養(yǎng)的重要成分，根據(jù)不同的培養(yǎng)條件和目的，選擇不同的基質(zhì)。

2 基于 Scaffold 基質(zhì)膠的 (SCAFFOLD-BASED) 3D 細(xì)胞培養(yǎng)法

基質(zhì)為細(xì)胞培養(yǎng)中的細(xì)胞提供支撐。細(xì)胞能夠增殖并遷移進(jìn)入基質(zhì)網(wǎng)絡(luò)內(nèi)部，終粘附到基質(zhì)上。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)時(shí)，成熟細(xì)胞相互影響，并終形成接近于細(xì)胞來(lái)源組織的微型結(jié)構(gòu)。在大部分情況下，這些細(xì)胞會(huì)表現(xiàn)為尺寸各異的球形，稱為細(xì)胞球：這些細(xì)胞結(jié)構(gòu)通常用于藥物篩選、評(píng)價(jià)或者其他 3D 細(xì)胞的應(yīng)用。通常，有基質(zhì)支撐的 3D 細(xì)胞培養(yǎng)方法獲得的細(xì)胞球，由于基質(zhì)提供了較大的接觸面積，其大小會(huì)比沒(méi)有基質(zhì)支撐的方法獲得的細(xì)胞球更大。

2.1 基質(zhì)的種類和成分

根據(jù)培養(yǎng)的細(xì)胞類型的不同，基質(zhì)蛋白纖維的特性和形狀應(yīng)與之相配合。基質(zhì)蛋白纖維的布局應(yīng)與模擬的器官結(jié)構(gòu)相符，具有類似的結(jié)構(gòu)、尺度和功能。然而，基質(zhì)纖維越大、結(jié)構(gòu)越復(fù)雜，就越難以提取。另外，為了防止任何可能出現(xiàn)的障礙 ( 免疫反應(yīng)、纖維化、影響生長(zhǎng) )，無(wú)論采用何種類型的基質(zhì)，所采用的基質(zhì)都必須為細(xì)胞生長(zhǎng)提供支撐，并具有生物相容性。基質(zhì)可以是水凝膠，薄膜 ( 或者管狀 )，和 3D 基質(zhì)結(jié)構(gòu)。

2.2 水凝膠基質(zhì)

凝膠具有很好的力學(xué)特征，是常用的基質(zhì)。它具有類似于組織的剛性，在某種程度上能夠很好地模擬細(xì)胞外基質(zhì)的作用。事實(shí)上，就像其他的基質(zhì)，凝膠這種空洞結(jié)構(gòu)就像一個(gè)能夠保持營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和可溶性因子 ( 如細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子 ) 的細(xì)胞外基質(zhì)，這些可溶性因子由細(xì)胞產(chǎn)生，在凝膠種擴(kuò)散，使細(xì)胞通過(guò)非直接接觸的方式進(jìn)行通訊聯(lián)系。通過(guò)這種方法，非常適合于進(jìn)行微型細(xì)胞實(shí)體組織的模擬，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行藥物的毒性檢測(cè)和評(píng)價(jià)等。

包含大量水和天然生物分子 ( 藻酸鹽、明膠、透明質(zhì)酸、瓊脂糖、層粘連蛋白、纖維蛋白 ) 都可作為基質(zhì)。但是其凝膠化基質(zhì)比較復(fù)雜，會(huì)使制備和操作非常困難。

合成的和天然的生物聚合物也可作為 3D 培養(yǎng)的凝膠。根據(jù)實(shí)驗(yàn)條件和終目的，可找到多種不同的聚合物，包括惰性的和可生物降解的。聚合物易于操作，更適合于構(gòu)建基質(zhì)。

其他類型基質(zhì)：除了水凝膠外，還有很多基質(zhì)材料可用。非凝膠聚合材料基質(zhì)常用于組織工程，不同的材料都需要符合所要模擬器官的機(jī)械和物理學(xué)特征。

3 無(wú)基質(zhì) (SCAFFOLD-FREE) 的 3D 細(xì)胞培養(yǎng)

要形成細(xì)胞球，細(xì)胞團(tuán)塊即可作為一種很好的生理模塊而無(wú)需依賴于固體物質(zhì)的支持。這樣獲得的細(xì)胞球通常比較小，也相對(duì)松散。主要的 scaffold-free 3D 細(xì)胞培養(yǎng)法就是 forced-floating ( 強(qiáng)制浮動(dòng)法 ), hanging drop ( 懸滴法 ) 和 agitation based( 攪動(dòng)法 )。

forced-floating ( 強(qiáng)制浮動(dòng)法 ) 是用*低粘附的聚合物包被的多孔板來(lái)進(jìn)行。通過(guò)向孔內(nèi)加入細(xì)胞懸液后進(jìn)行離心獲得。

懸滴法是通過(guò)將含有細(xì)胞的液滴處理，使細(xì)胞聚集為緊湊的均一的細(xì)胞球。

agitation based ( 攪動(dòng)法 ) 使用生物反應(yīng)器獲得三維的細(xì)胞球結(jié)構(gòu)。