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進口PCR實驗原理及反應要素介紹
聚合酶鏈式反應
一、發展簡史
聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction,PCR）是一種用于放大擴增特定的DNA片段的分子生物學技術，它可看作是生物體外的特殊DNA復制，PCR的特點，是能將微量的DNA大幅增加。因此，無論是化石中的古生物、歷史人物的殘骸，還是幾十年前兇殺案中兇手所的毛發、皮膚或血液，只要能分離出一丁點的DNA，就能用PCR加以放大，進行比對。這也是"微量證據"的威力之所在。
1983年美國Mullis首先提出設想，1985年由其發明了聚合酶鏈反應，即簡易DNA擴增法，意味著PCR技術的真正誕生。
二、實驗原理
類似于DNA的體內復制。
首先待擴增DNA模板加熱變性解鏈，隨之將反應混合物冷卻至某一溫度，這一溫度可使引物與它的靶序列發生退火，再將溫度升高使退火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸。這種熱變性-復性-延伸的過程就是一個PCR循環。
PCR過程是由變性，退火，延伸3個步驟組成的不斷重復的過程。標準的PCR過程分為三步：
1.DNA變性（90℃-96℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下，氫鍵斷裂，形成單鏈DN
2.退火（復性）（40℃-65℃）：系統溫度降低，引物與DNA模板結合，形成局部雙鏈。
3.3.延伸（68℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右的活性）的作用下，以dNTP為原料，從引物的5′端→3′ 端延伸，合成與模板互補的DNA鏈。
每一循環經過變性、退火和延伸，DNA含量既增加一倍。
三、PCR反應要素：
- DNA模版：可以是雙鏈、單鏈、提取染色體的DNA、克隆的質粒DNA，
- 引物：一對寡聚DNA，分別與模板兩側的3’端序列互補，可使DNA序列得到擴增
- DNA聚合酶（TaqDNA聚合酶）：催化DNA合成，
- 緩沖液：提供DNA合成反應所需的PH,離子強度等環境
- 4種單核苷酸：dNTP,提供DNA合成原料
- 實驗材料
PCR擴增儀、PCR反應管、PCR離心管、移液器、凝膠電泳設備、冰盒、離心機
模板、PCR引物、TaqDNA聚合酶、dNTP反應緩沖液、Mg2+、ddH2O。
- PCR反應體系
- 以DNA為模板的反應體系：
模板：DNA102~105拷貝
引物
底物：4種dNTP
TaqDNA聚合酶
緩沖液
體積：
- 以mRNA為模板的反應（逆轉錄PCR）
模板：RNA
引物：oligo(dT)12~18
底物：4種dNTP
逆轉錄酶
緩沖液
其他試劑：RNA酶抑制劑，MgCl2.DTT.