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定量PCR儀主要由兩部分組成，一個(gè)是PCR系統(tǒng)，一個(gè)是熒光檢測(cè)系統(tǒng)。選擇定量PCR儀的關(guān)鍵——由于定量PCR必需借助樣本和標(biāo)準(zhǔn)品之間的對(duì)比來(lái)實(shí)現(xiàn)定量的，對(duì)于定量PCR系統(tǒng)來(lái)說(shuō)，重要的參數(shù)除了傳統(tǒng)PCR的溫控性、升降溫速度等等，更重要的還在于樣品孔之間的均一性，以避免微小的差別被指數(shù)級(jí)放大。至于熒光檢測(cè)系統(tǒng)，多色多通道檢測(cè)是當(dāng)今的主流趨勢(shì)——儀器的激發(fā)通道越多，儀器適用的熒光素種類越多，儀器適用范圍就越寬；多通道指可同時(shí)檢測(cè)一個(gè)樣品中的多種熒光，儀器就可以同時(shí)檢測(cè)單管內(nèi)多模版或者內(nèi)標(biāo)+樣品，通道越多，儀器適用范圍越寬、性能就更強(qiáng)大。熒光檢測(cè)系統(tǒng)主要包括激發(fā)光源和檢測(cè)器。激發(fā)光源有鹵鎢燈光源、氬離子激光器、發(fā)光二極管LED光源，前者可配多色濾光鏡實(shí)現(xiàn)不同激發(fā)波長(zhǎng)，而單色發(fā)光二極管LED價(jià)格低、能耗少、壽命長(zhǎng)，不過(guò)因?yàn)槭菃紊枰煌腖ED才能更好地實(shí)現(xiàn)不同激發(fā)波長(zhǎng)。監(jiān)測(cè)系統(tǒng)有*低溫CCD成像系統(tǒng)和PMT光電倍增管，前者可以一次對(duì)多點(diǎn)成像，后者靈敏度高但一次只能掃描一個(gè)樣品，需要通過(guò)逐個(gè)掃描實(shí)現(xiàn)多樣品檢測(cè)，對(duì)于大量樣品來(lái)說(shuō)需要較長(zhǎng)的時(shí)間。定量PCR儀需要考慮的另外一個(gè)因素是軟件設(shè)計(jì)，這一點(diǎn)目前較新型號(hào)的儀器都有不錯(cuò)的配套軟件可以滿足常規(guī)使用。——隨著定量PCR技術(shù)在臨床診斷、疾病監(jiān)控、藥物監(jiān)測(cè)、腫瘤研究等領(lǐng)域的越來(lái)越廣泛的應(yīng)用，市面上不同品牌和設(shè)計(jì)的定量PCR儀也不斷推陳出新。

1. 傳統(tǒng)的96孔板式定量PCR儀
傳統(tǒng)的96孔板式定量PCR儀以美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司(ABI)為代表。傳統(tǒng)96孔板式定量PCR儀的優(yōu)點(diǎn)是可容納的樣本量大而且無(wú)需特殊耗材，可以采用傳統(tǒng)的96孔板甚至384孔板進(jìn)行批量的定量反應(yīng)，但是缺點(diǎn)也顯而易見——溫度均一性不佳——平板固定加熱模塊的PCR溫度控制有邊緣效應(yīng)——樣品槽上每個(gè)孔之間的溫度存在差異——也就是所謂位置效應(yīng)（可參考生物通龍虎榜：PCR儀的選擇一文），因此標(biāo)準(zhǔn)曲線的反應(yīng)條件應(yīng)難以做到與樣本*一致，樣本和樣本之間的溫度控制也可能存在差異，對(duì)于靈敏度的定量PCR來(lái)說(shuō)，任何極微小的差異都會(huì)以指數(shù)級(jí)別的規(guī)模被放大，不能不說(shuō)是一種缺憾。傳統(tǒng)反應(yīng)板面積大，溫度控制的性、升降溫速度也相對(duì)較慢，因而反應(yīng)速度也較慢。96孔板定量PCR儀的熒光檢測(cè)分析系統(tǒng)，由于96孔板上樣品孔的位置是固定的，每個(gè)樣品孔距離光源和監(jiān)測(cè)器的光程各不相同，有可能對(duì)結(jié)果產(chǎn)生影響。檢測(cè)在試管管底進(jìn)行，試管底的透光性和厚薄均一性都可能對(duì)結(jié)果產(chǎn)生影響。MJ和Bio-Red公司的定量PCR儀也屬于這一類。

ABI的7500型熒光定量PCR儀激發(fā)光源為鹵鎢燈光源，5色濾光鏡，可同時(shí)激發(fā)96個(gè)樣品，*低溫CCD具備同時(shí)多點(diǎn)多色檢測(cè)的能力，能夠有效地分辨FAM/SYBR Green I, VIC/JOE, NED/ TAMRA/ Cy3, ROX/Texas Red,和Cy5等熒光染料。多色熒光檢測(cè)技術(shù)為多重定量、SNP分析、基因型分型和帶陽(yáng)性內(nèi)對(duì)照的陰/陽(yáng)性分析提供了基礎(chǔ)。多重定量即在同一反應(yīng)管內(nèi)同時(shí)對(duì)多個(gè)目標(biāo)基因進(jìn)行定量，可以大大提高精度并節(jié)約成本。隨機(jī)配置的定量PCR引物和探針設(shè)計(jì)軟件Primer Express非常有用，“因?yàn)榈侥壳盀橹惯€沒(méi)有其他軟件有能力設(shè)計(jì)定量PCR所需的TaqMan探針”。 各型號(hào)都有實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)(Real-Time)和終點(diǎn)讀板(Plate Read)兩種運(yùn)行模式。實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)模式用于定量DNA或RNA拷貝數(shù)。可以動(dòng)態(tài)顯示PCR擴(kuò)增曲線的生成，定量的線性范圍大于9個(gè)數(shù)量級(jí)，區(qū)分5000和10000個(gè)拷貝的DNA模板可信度達(dá)99.7%。終點(diǎn)讀板模式用于基因型鑒定、點(diǎn)突變檢測(cè)和單核苷酸多態(tài)性(SNP)分析等。當(dāng)然，也可以作為普通PCR儀使用。ABI定量PCR儀的優(yōu)勢(shì)在于ABI已經(jīng)發(fā)布十二萬(wàn)種Taqman Gene Expression Assays 人、大鼠、小鼠基因組基因表達(dá)分析試劑盒，覆蓋人類全部4萬(wàn)個(gè)基因，二百萬(wàn)種Taqman Validated SNP Genotyping Assays 人、大鼠、小鼠基因組SNP檢測(cè)試劑盒，為運(yùn)用7000、7300、7500、7900型開展課題研究創(chuàng)造了的條件。ABI 的定量PCR儀均支持兩種定量化學(xué)：TaqMan熒光探針和SYBR Green I熒光染料。其熔解曲線(Dissociation Curve)功能用于判斷PCR擴(kuò)增反應(yīng)是否特異，有無(wú)雜帶生成。7500型號(hào)比7300多一個(gè)濾光鏡，新的光路設(shè)計(jì)使長(zhǎng)波長(zhǎng)紅色熒光的檢測(cè)靈敏度大大提高，帶有快速運(yùn)行模式。增強(qiáng)的7900型在96孔模塊的基礎(chǔ)上更加可以更換384孔版模塊，使得高通量處理數(shù)據(jù)的能力大大增強(qiáng)，應(yīng)該更適合經(jīng)常處理大量標(biāo)本的實(shí)驗(yàn)室。

MJ的Option系列是在MJ原來(lái)的常規(guī)PCR儀基礎(chǔ)上改造，采用LED光源PMT光電倍增管熒光檢測(cè)器。 96個(gè)單色LED光源對(duì)應(yīng)96孔板，但是單色LED激發(fā)波長(zhǎng)范圍較窄。Option是單道單個(gè)光電倍增管熒光檢測(cè)器，升級(jí)的Option2是雙PMT光電倍增管熒光檢測(cè)器，PMT靈敏度高但一次只能掃描一個(gè)樣品，所以O(shè)ption系列是逐孔掃描而非同時(shí)檢測(cè)96個(gè)樣品。雙PMT可同時(shí)進(jìn)行雙色檢測(cè)(FAM/SYBR Green I；VIC/Joe/TAMRA)。優(yōu)勢(shì)之一是帶梯度功能。Bio-Rad(伯樂(lè))也算是個(gè)熟悉的品牌，iCycler iQ實(shí)時(shí)定量PCR系統(tǒng)也是96孔平板式固定加熱的，熒光檢測(cè)波長(zhǎng)范圍400-700nm，可4波長(zhǎng)同時(shí)檢測(cè)，儀器的設(shè)計(jì)靈活，定性和定量部分可獨(dú)立工作，同樣可完成梯度PCR。5組濾光片位置使用戶可以自由選擇不同的檢測(cè)波長(zhǎng)。技術(shù)intensifier熒光放大器保證了的檢測(cè)靈敏度。MJ被Bio-Rad收購(gòu)后，Option和iCycler iQ目前還是各自走各自的銷售渠道，至于將來(lái)Bio-Rad會(huì)如何決定二者的發(fā)展方向還需要拭目以待。

2.創(chuàng)新概念的離心式實(shí)時(shí)定量pcr儀
為了克服平板式定量pcr溫度均一性差的缺點(diǎn)，聰明的研究人員又開發(fā)出創(chuàng)新概念的離心式實(shí)時(shí)定量pcr儀，以roche羅氏的lightcycle和corbett的rotor-gene為代表。pcr擴(kuò)增樣品槽被巧妙地設(shè)計(jì)為離心轉(zhuǎn)子的模樣，借助空氣加熱和轉(zhuǎn)子在腔內(nèi)旋轉(zhuǎn)，轉(zhuǎn)子上每個(gè)孔都是“等位”的，幾乎無(wú)差別，很好的解決了每個(gè)樣品孔之間的溫度均一性的關(guān)鍵問(wèn)題——corbett的rotor-gene樣品間溫度差異小于±0.01℃地保障了標(biāo)準(zhǔn)曲線和樣品之間條件的一致性。利用空氣做加熱介質(zhì)的優(yōu)點(diǎn)在于能實(shí)現(xiàn)與反應(yīng)體系無(wú)縫接觸，接觸面積大且加熱均勻。雖然有競(jìng)爭(zhēng)對(duì)手批評(píng)空氣介質(zhì)比熱小，但事實(shí)上roche的lightcycle%202.0卻是目前升溫速度快的定量pcr儀，可以達(dá)到20℃/秒！Corbett的Rotor-gene也可以達(dá)到5℃/秒(樣品實(shí)際升溫速度達(dá)到2.5℃/秒)，優(yōu)于多數(shù)的平板式PCR儀。借助旋轉(zhuǎn)離心力還可以隨時(shí)將可能凝在管壁和蓋子上的液滴離心到管底而無(wú)需熱蓋；還可以將酶加在管蓋上，升溫后離心到管底與反應(yīng)體系混合，實(shí)現(xiàn)“機(jī)械的熱啟動(dòng)功能”。由于升溫速度快，對(duì)于常規(guī)需要2個(gè)多小時(shí)完成的定量PCR反應(yīng)，Roche的LightCycler僅需20—30分鐘即可完成，可以大大節(jié)約時(shí)間和提高工作效率。這一點(diǎn)對(duì)于研究人員來(lái)說(shuō)極為有用，因?yàn)槟悴辉傩枰?個(gè)多小時(shí)才能看實(shí)驗(yàn)結(jié)果了，或者換句話來(lái)說(shuō)，2個(gè)多小時(shí)你可以做4—5輪定量實(shí)驗(yàn)了。