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PCR工作機(jī)制
閱讀：801 發(fā)布時(shí)間：2023-8-18
PCR的工作機(jī)制
PCR由一系列復(fù)雜的化學(xué)反應(yīng)，包含前、中、后三個(gè)階段。最重要的化學(xué)變化是熱循環(huán)期間的產(chǎn)物合成。每次循環(huán)后產(chǎn)物、模板、聚合酶、引物和脫氧核苷酸的余量都會(huì)改變，處于連續(xù)的不穩(wěn)定狀態(tài)。所有的循環(huán)都是從模板和先前產(chǎn)物的變性開(kāi)始。當(dāng)溫度較低時(shí)，引物退火到模板上。
早先若干循環(huán)的退火步驟要求引物尋找正確的染色體模板作為它們的目標(biāo)。在中期的循環(huán)中，先前合成的產(chǎn)物優(yōu)先成為模板。最后幾個(gè)循環(huán)中，增擴(kuò)后的高濃度產(chǎn)物互相雜交，由此阻止與引物的雜交。
引物退火后，Taq DNA聚合酶把自己定位到引物和模板綜合體上，提取介質(zhì)中的自由dNTPs然后沿著模板延伸。從本質(zhì)上講，引物和模板的任何反應(yīng)都會(huì)造成產(chǎn)物擴(kuò)展，它們的特異性在最初的幾個(gè)循環(huán)中可能很難控制，得到非特異性產(chǎn)物的摩爾量超過(guò)在模板上正確退火位置的量。PCR反應(yīng)特異性的可靠度依賴于2個(gè)引物必須定位到互補(bǔ)的DNA鏈上。進(jìn)一步講，退火溫度和Mg2+離子的濃度影響引物穩(wěn)定的雜交到模板上，雜交位置間距應(yīng)小于10kb。
相比之下，增擴(kuò)階段的大部分循環(huán)里，模板被很好的與先前增擴(kuò)的片段區(qū)分開(kāi)。這些片段的數(shù)量取決于早先若干個(gè)循環(huán)的嚴(yán)密性。甄選同源性引物的退火位置是較簡(jiǎn)單的，增擴(kuò)期間由染色體DNA貢獻(xiàn)的有效的模板數(shù)量只是可以忽略一小部分。甄選的復(fù)雜性被超量由引物從互補(bǔ)位點(diǎn)新增擴(kuò)的片段所降低。
PCR的化學(xué)計(jì)量
熱力學(xué)方面的影響對(duì)PCR來(lái)講是試劑濃度和模板間的對(duì)應(yīng)關(guān)系。在起先的循環(huán)中PCR試劑的摩爾比率是最高的，隨著PCR產(chǎn)物的增加而降低。令人驚訝的是這種減低是由增擴(kuò)的目標(biāo)分子的增加引起的而不是由于試劑的消耗。最初剩余的引物和脫氧核苷酸與模板的比率是固定的，反應(yīng)結(jié)束后，dNTP的濃度下降超過(guò)1倍，引物任然剩余95%，Taq DNA聚合酶沒(méi)有變化。增擴(kuò)千萬(wàn)倍目標(biāo)分子后，模板分子遠(yuǎn)多于酶分子。當(dāng)產(chǎn)物增加后，酶全部被占用了，引物和模板的比率減低，推動(dòng)自身退火。當(dāng)自身退火的數(shù)量增加或酶的總量有時(shí)，反應(yīng)處于飽狀態(tài)并停止指數(shù)級(jí)的增長(zhǎng)。增擴(kuò)階段是自我受限的。這個(gè)階段之后，熱循環(huán)轉(zhuǎn)向未在最初幾個(gè)循環(huán)中被選擇的欺騙性的目標(biāo)增擴(kuò)，盡管能夠通過(guò)提高開(kāi)始時(shí)Taq DNA聚合酶和引物的含量來(lái)維持高試劑比率，但這種修改很可能引起丟失特異性因?yàn)橐飼?huì)胡亂雜交，出現(xiàn)額外的條帶和斑點(diǎn)。