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流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)中的常見(jiàn)問(wèn)題及其解決方法

閱讀:4596      發(fā)布時(shí)間:2018-3-6
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本文匯總了流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)中常見(jiàn)問(wèn)題(無(wú)法標(biāo)記、PE抗體檢測(cè)不到但FITC可檢測(cè)到、非特異性染色、熒光強(qiáng)度弱、散射光信號(hào)異常、結(jié)果與預(yù)期相反等),并給出了各種可能的原因以及對(duì)應(yīng)的解決方法,希望對(duì)您實(shí)驗(yàn)有所幫助。  

 

一、細(xì)胞無(wú)法標(biāo)記 

1.確保所有的抗體都按照廠商的說(shuō)明書(shū)正確存儲(chǔ)。

2.確保商品化抗體沒(méi)有超過(guò)有效期。

3.確保已正確加入足量的抗體。 

4.確保抗體已連接熒光素。如果未連接熒光素,需加入連接有熒光素的二抗。

5.確保二抗是好的,也就是說(shuō)二抗曾經(jīng)能與另外的一抗成功結(jié)合。

6.確保使用了正確的二抗,就是說(shuō)二抗能夠識(shí)別你的一抗。 

如果使用的是PE或APC熒光素的抗體,確保該抗體未被冰凍過(guò)。 
你要檢測(cè)的組織上是否表達(dá)該抗原?可查看相關(guān)文獻(xiàn)了解該抗原的表達(dá)情況,或者同時(shí)做一個(gè)陽(yáng)性對(duì)照。 
抗體是否能識(shí)別檢測(cè)物種的抗原位點(diǎn)?可檢查抗體的交叉反應(yīng)列表,看看抗體是否適用于你要檢測(cè)的物種標(biāo)本。不是所有的抗體都能夠檢測(cè)所有物種相應(yīng)抗原。 7.確保使用正確的激光來(lái)激發(fā)熒光素,并使用了正確的通道來(lái)檢測(cè)該熒光。  

 

二、PE抗體無(wú)法標(biāo)記,而FITC抗體的結(jié)果卻很好 

1.PE熒光素可能冰凍過(guò)。如果冰凍過(guò),建議另外買(mǎi)一管新的抗體。 

2.多聚甲醛(PFA)可能會(huì)導(dǎo)致此問(wèn)題。PFA降解后可釋放出甲醇,從而影響染色。所以切記PFA盡可能新鮮配制,或者細(xì)胞盡可能不要固定,染完色就立即檢測(cè)。  

 

三、非特異性染色 

1.非特異性染色可能是由于自發(fā)熒光。 
解決方法:用一管只加細(xì)胞不加抗體的空白管,查看細(xì)胞自發(fā)熒光水平。 
某些細(xì)胞可表達(dá)低親和力的Fc受體CD16/CD32,這種受體可通過(guò)Fc片段結(jié)合大多數(shù)抗體。對(duì)于小鼠細(xì)胞,可使用SeroBlockFcR阻斷該位點(diǎn)。 

2.非特異性染色也可能是由于二抗引起,建議選擇一種只與一抗反應(yīng)、卻不會(huì)與檢測(cè)組織發(fā)生交叉反應(yīng)的二抗。 確保洗滌充分。 

3.小心滴定抗體。降低抗體濃度可減少非特異性染色。   

 

四、熒光強(qiáng)度弱

1.熒光弱可能是由于抗體過(guò)度稀釋。因此使用前通過(guò)正確滴定抗體,以確保抗體濃度適當(dāng)。

2.直標(biāo)時(shí),熒光弱也可能是由于前帶現(xiàn)象引起(概念見(jiàn)表格后解釋?zhuān)虼耍⌒恼_滴定抗體很有必要。 

3.熒光弱可能由于細(xì)胞數(shù)量過(guò)多。建議正確調(diào)整細(xì)胞密度,一般低于1×10E7/ml。

4.熒光弱可能是由于抗原本身就表達(dá)低,可通過(guò)查閱文獻(xiàn),明確抗原表達(dá)水平。

5.如果查閱到該抗原確實(shí)本身表達(dá)弱,那么建議選擇更亮的熒光素。

6.在交叉反應(yīng)明顯的抗體中,其熒光強(qiáng)度弱于特異性高的單克隆抗體。

7.一抗或二抗的孵育時(shí)間和溫度均需優(yōu)化。 散射光異常 

8.確保細(xì)胞是新鮮收集的,否則容易出現(xiàn)大量死細(xì)胞和碎片。

9.對(duì)細(xì)胞進(jìn)行刺激、活化時(shí),可影響細(xì)胞散射光特性。 

10.如果要裂解紅細(xì)胞,確保裂解液新鮮配制并且配制正確。  

 

五、結(jié)果與預(yù)期的相反 

1.有些試劑可能會(huì)影響某些抗原檢測(cè),例如EDTA可影響一些血小板標(biāo)記的檢測(cè)。

2.裂解液也可以影響一些抗原檢測(cè),此時(shí)可采用PBMC提取法試試。 

3.有些抗原是表達(dá)在胞內(nèi)的,故需選擇正確的破膜劑進(jìn)行正確的破膜處理。  

前帶現(xiàn)象:1929年Heidelberger利用等量抗體檢測(cè)濃度遞增抗原,當(dāng)抗原濃度較低,抗體濃度相對(duì)較高時(shí),沉淀反應(yīng)不明顯;當(dāng)抗原濃度增加到與抗體濃度比例合適時(shí),沉淀反應(yīng)明顯;繼續(xù)增加抗原濃度時(shí),沉淀反應(yīng)反而減弱。據(jù)此繪出雙相應(yīng)答曲線,曲線高峰區(qū)域,抗體、抗原濃度呈zui適比,沉淀反應(yīng)明顯,稱等價(jià)帶。高峰區(qū)域左側(cè),由于抗體濃度過(guò)高,沉淀反應(yīng)不明顯,稱前帶;高峰區(qū)域右側(cè)。由于抗原濃度過(guò)高,沉淀反應(yīng)也不明顯,稱后帶。抗體濃度過(guò)高所致結(jié)果稱前帶現(xiàn)象,抗原濃度過(guò)高所致結(jié)果稱后帶現(xiàn)象,統(tǒng)稱為帶現(xiàn)象。1977年Green把此現(xiàn)象稱為鉤狀效應(yīng)(hook effect),包括了前后帶現(xiàn)象。

 

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