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生物技術藥物質量控制，液相色譜大顯身手
導 讀
生物技術藥物（以下簡稱生物藥）主要指采用DNA重組技術或者其他創新生物技術生產的一大類預防、診斷和治療疾病的藥物，是醫藥行業冉冉升起的明星。主要成員有抗體藥物、重組蛋白和多肽、核酸和寡核苷酸、疫苗、干細胞和免疫細胞工程等。這些新型藥物在腫瘤、慢性病、遺傳罕見病、新冠肺炎流行病等疾病防治上各顯神通，比如抗擊癌癥的猛將抗體藥物、新冠肺炎戰線上的mRNA疫苗、又或者是近期刷屏的治療遺傳罕見病的天價寡核苷酸藥物，都在為廣大患者解除病痛、改善生活質量上屢立奇功。
為什么生物藥研發有挑戰性呢？
如此奇效的生物藥，開發和生產卻是困難重重，比化學藥物投入成本更高、周期更長。比如開發一個創新生物藥需要耗費至少10億美元，約10~20年的周期。為什么生物藥的研發這么有挑戰性呢？主要是由于生物藥具有分子量大、結構復雜和可變性、容易受到各種理化因素影響等特點，在生物發酵（細胞培養）、目標產物的分離純化等復雜生產過程中存在異變性，為藥物的有效性和安全性的評價帶來了很多考驗。
島津生物技術藥物解決方案
液相色譜篇
基于生物藥的結構復雜性和異變性，需要對其進行全面的檢測和質量控制，以保證產品的安全和有效。島津密切關注生物藥質量研究和控制，繼推出《蛋白類生物技術藥物開發和臨床試驗解決方案》后，細化生物藥研究領域，又推出了《生物藥雜質與輔料分析解決方案》，本次結合近期的研究成果，特推出《島津生物技術藥物解決方案——液相色譜篇》應用文集，聚焦液相色譜在生物藥質量研究和控制中的應用。
解決方案內容
一、一般抗體類藥物分析
1.1. 聚集體分析
1)生物兼容液相系統Nexera Bio分析Fc融合蛋白多聚體
2)生物兼容液相系統Nexera Bio分析貝伐單抗生物類似藥多聚體
3)生物兼容液相系統Nexera Bio分析阿達木單抗聚集體
4)生物兼容液相系統Nexera Bio分析雙抗樣品的大小異質性
1.2. 電荷異質性分析
1)生物兼容液相系統Nexera Bio分析貝伐單抗生物類似藥電荷異質體
2)生物兼容液相系統Nexera Bio在單抗樣品電荷異質性分析中的應用
1.3. 肽圖分析
1)使用一體化液相色譜儀i-Series進行抗體藥物肽圖分析
2)使用Nexera LC-40和LCMS-2020對曲妥珠單抗進行肽圖分析
1.4. 糖型分析
1)超高效液相色譜法用于抗體中唾液酸的測定
2)利用超高效液相色譜儀連接熒光檢測器和四極桿飛行時間質譜儀對曲妥珠單抗游離N糖進行分離與鑒定
二、抗體藥物偶聯物分析
1)疏水作用色譜法（HIC）在抗體藥物偶聯物（ADC）藥物抗體比值（DAR）和藥物分布測定中的應用
2)抗體藥物偶聯物的藥物抗體偶聯比的檢測
3)ADC原液中DMA溶劑殘留的檢測
三、mRNA、重組蛋白和多肽藥物分析
1)生物兼容液相系統用于核酸藥物純度分析
2)生物兼容液相系統Nexera Bio聯合蒸發光散射檢測器測定mRNA遞送介質DMG-PEG2000的含量
3)生物兼容液相系統Nexera Bio聯合蒸發光散射檢測器測定抗體藥物中吐溫80的含量
4)尺寸排阻色譜法測定重組人干擾素α2a注射劑中主成分含量
5)尺寸排阻色譜法測定重組人干擾素α2b注射劑中主成分含量
6)體積排阻色譜法用于注射用重組人白介素-11的純度分析
7)利用Nexera LC-40方法轉移功能，建立卡貝縮宮素注射液有關物質UHPLC測定法
典型案例，先睹為快
1生物兼容液相色譜分析雙特異性抗體大小異質性
非片段化設計的雙抗分子量較大，通常需要采用尺寸排阻色譜法（SEC）對其大小異質性行分析，反映雙抗連接情況，保障產品質量。
雙抗樣品分離色譜圖
分離度和重復性結果
該雙抗樣品中各色譜峰峰形良好，分離度均大于1.5，分離良好。保留時間和峰面積的RSD %分別在0.02~0.03 %和0.12~0.64 %之間，方法重復性好。
2生物兼容液相分析抗體藥物偶聯物（ADC）的藥物抗體比（DAR）值
藥物抗體偶聯比（DAR）是抗體所連接藥物數量的平均值，是ADC的關鍵質量屬性。疏水作用色譜是檢測抗體藥物偶聯物DAR值的常用分析技術，通常采用非變性的色譜條件，可使ADC藥物保持完整的狀態。疏水作用色譜能將不同DAR值的組分分開，從而能直接測定不同DAR值組分的比例。
ADC藥物疏水作用色譜圖
ADC藥物負荷分布和DAR計算
注：平均DAR=Σ（加權峰面積）/100；譜圖中較小的a峰是偶聯3個藥物的組分。
使用疏水作用色譜測定了ADC藥物實際樣品，得到了該藥物的DAR分布，并計算了該藥物的平均DAR。
3超高效液相色譜聯合熒光檢測器分析曲妥珠單抗N糖譜
單抗藥物功能的實現與其糖基化修飾密切相關，糖基化修飾會影響蛋白的性能，如構象、穩定性、溶解度、藥物代謝動力學、活性及免疫原性等。2020版《中國藥典》第三部新增了《3130-單抗N糖譜測定法》指導原則，我們參考該指導原則建立了曲妥珠單抗游離N糖譜分析方法，方法分離度好，重復性好。
曲妥珠單抗N糖譜連續進樣色譜圖（n=6）
4一體化液相色譜分析曲妥珠單抗肽圖
HPLC肽圖分析不但可以比較生物類似藥與原研藥一級結構的一致性，還可以通過不同批次產品的肽圖的比較來驗證工藝穩定性，因此肽圖分析在蛋白類生物藥質量控制中至關重要。
曲妥珠單抗酶解樣品連續進樣色譜圖
（n=6，280 nm）
曲妥珠單抗酶解產物形成的眾多色譜峰得到了高效分離，六次重復進樣的重復性良好，方法穩定可靠，適用于肽圖一致性評估。
5生物兼容液相聯合ELSD分析抗體藥物輔料吐溫80含量
吐溫80是抗體藥物生產中用到的一種輔料，可減少蛋白聚集以及蛋白在容器表面的吸附。但吐溫80本身及其降解副產物可能會對人體健康造成威脅，故建立抗體藥物中吐溫80的含量檢測的方法對控制藥物輔料安全性具有重要意義。
抗體制劑T-1和T-2中吐溫80色譜圖
我們開發了一種檢測抗體藥物中吐溫80含量的方法，并應用于兩種抗體制劑中吐溫80含量的測定，兩種抗體制劑中吐溫80的含量分別為144.3 μg/mL和404.1 μg/mL。
結語
生物藥具有治療針對性強、用量少、療效好且安全性較高等優點，近年來得以飛速發展。生物藥質量控制是生物藥安全有效的保證，是生物藥生產的關鍵環節。島津液相色譜性能卓越、穩定耐用，是生物藥質量控制的好幫手。《島津生物技術藥物解決方案——液相色譜篇》（←點擊查看）應用文集，匯集島津生物藥液相色譜分析新方案，涵蓋雙特異性抗體、抗體藥物偶聯物（ADC）、mRNA疫苗等時下熱門的生物藥物。
撰稿人：唐雪
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