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干貨分享丨mRNA疫苗關鍵質量控制解決方案
近期，美國食品藥品監督管理局（FDA）授予黑色素瘤mRNA疫苗“突破性療法”的認定，這是全球首個獲此認證的mRNA腫瘤疫苗。國內首款新型冠狀病毒mRNA疫苗也于近期納入緊急使用。mRNA疫苗是目前最炙手可熱的醫藥領域之一，被譽為“全能鑰匙”的mRNA疫苗，理論上能夠表達任何蛋白，在疫苗、腫瘤治療、先天性代謝疾病等領域都有著極為廣闊的前景。但作為一類全新的疫苗，其質量控制仍處于探索階段，一起來看看島津最新的應用研究成果！
mRNA疫苗作用原理與生產流程
mRNA疫苗是通過將編碼抗原蛋白的mRNA接種至人體，mRNA作為模板合成抗原蛋白，誘導或激活機體免疫系統產生免疫反應，從而預防和治療疾病。
mRNA的生產工藝流程主要包括以下五步：質粒制備，體外轉錄，體外修飾，純化，載體遞送。
mRNA疫苗質量控制
根據mRNA疫苗制備流程，島津結合自身儀器建立了mRNA疫苗質量控制解決方案。
方案優勢：
l 此方案涵蓋了mRNA生產工藝流程中關鍵質量控制，且同一個分析項目提供多種儀器的解決方案，內容豐富。
l 方案中涉及的島津新款儀器在mRNA質量控制中表現出優異性能，如蒸發光散射檢測器ELSD-LT III、生物惰性液相色譜儀Nexera XS inert、基質輔助激光解吸電離-飛行時間質譜儀MALDI-8030等儀器。
質粒構型分析
質粒具有3種基本構型：超螺旋(Supercoiled，簡稱SC)、線性(Linear)和開環(Opencircular，簡稱OC)。島津采用生物惰性液相分析3種構型質粒，實現基線分離，可用于超螺旋質粒純度的測定。
圖片生物惰性液相色譜儀實物圖（左）和3種狀態質粒色譜圖（右）
mRNA原料定性分析
mRNA制備過程中非常重要的一步是將DNA轉錄為RNA，其中需要用到的原料有三磷酸核苷（NTPs）。島津通過單四極桿質譜(LCMS-2050)確定不同NTPs分子量，從而對原料進行定性分析。LCMS-2050標配DUIS（ESI+APCI）離子源，質量范圍廣，兼顧了小型化及高性能。
LCMS-2050實物圖（左）和mRNA合成原料ATP質譜圖（右）
mRNA疫苗加帽率分析
帽子結構是mRNA翻譯起始的必要結構，為核糖體識別mRNA提供了信號，協助核糖體與mRNA結合，使翻譯從AUG開始。同時帽子結構可增加mRNA的穩定性，保護mRNA免遭核酸外切酶的攻擊。所以，加帽率的高低直接影響著mRNA疫苗的藥效及穩定性。島津推薦通過MALDI-TOF(MALDI-8030)或QTOF(LCMS-9030 /9050)對加帽率進行檢測，其中MALDI-TOF測定加帽率操作簡便快速，無需優化流動相、色譜柱等繁瑣操作。
MALDI-8030實物圖（左）和mRNA樣品加帽后質譜圖（右）
mRNA疫苗純度分析
mRNA 純度對于保障 mRNA 疫苗的有效性和安全性至關重要。由于mRNA中含磷酸基團，在常規液相系統中容易產生金屬吸附，從而影響分析的靈敏度、精密度等性能。島津生物惰性液相系統中管路經peek內襯，整個流路無不銹鋼金屬材料，從而抑制金屬吸附，完美實現mRNA純度分析。
生物惰性液相色譜儀實物圖（左）和mRNA純度分析結果（右）
遞送介質分析
為了mRNA免受核酸酶的攻擊，并允許傳遞進入細胞，需要使用遞送系統。目前mRNA疫苗遞送介質主要為脂質納米粒（LNP），其由四種成分組成，分別是膽固醇，修飾化PEG，可離子化脂質和輔助脂質。
因LNP組分無紫外和熒光信號，因此推薦使用液相色譜聯合蒸發光散射檢測器（ELSD）定量分析LNP四種成分。ELSD-LT III是島津最新一代蒸發光散射檢測器，具有靈敏度高、線性范圍廣等優異特性，在樣品分析時采用wide模式，無需優化增益值，可同時快速分析四種不同含量的LNP成分。
ELSD-LT III檢測器實物圖（左）和LNP色譜圖（右）
根據中國藥典，可采用基質輔助激光解吸附飛行時間質譜(MALDI-TOF)等方法測定LNP成分之一聚乙二醇的重均/數均分子量及多分散性。利用島津MALDI-8030即可分析PEG分子量。
MALDI-8030實物圖（左）和PEG質譜圖（右）
使用島津掃描探針顯微鏡（SPM-9700HT），測定了mRNA疫苗樣品的表面形貌，并使用儀器自帶的軟件一鍵將其轉換成了更加清晰、直觀的三維形貌圖。
掃描探針顯微鏡SPM-9700HT實物圖（上）和mRNA表面形貌圖（下）
結語
mRNA技術應用前景非常廣闊，除了能夠用于預防傳染性疾病，也為治療腫瘤、免疫疾病帶來了新的星火。但mRNA在序列設計和遞送系統等環節還存在一定的技術壁壘，眾多mRNA疫苗仍處于研發和臨床階段，希望島津mRNA質量控制解決方案為mRNA疫苗的發展添磚加瓦。
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