1.細胞系將處理好的蓋玻片放在12孔板底部

如果細胞貼壁不牢（如HEK293）或者是半貼壁細胞（如 PC12），可以用細胞刮子將鼠尾膠原均勻地涂抹在玻片上包被。也可使用多聚賴氨酸，但是效果不如鼠尾膠原。事實上大部分貼壁的細胞都不用進行包被。如果在操作中發現細胞脫片嚴重，則可考慮進行包被來提高細胞貼壁能力。

2.將與培養基混勻后的細胞懸液加入孔中

這一步混勻非常重要，如果不勻，一般細胞都會聚集在玻片中央區域，會對形態觀察產生不利影響。分細胞的時候要注意進行形態觀察的時候應該將細胞分得相對稀一些，密集的細胞不利于形態觀察。每孔細胞的數量根據細胞大小的不同應該作出相應調整，一般104個細胞即可。

3.待24h后，細胞貼壁，即可進行轉染

初次試驗建議轉染陽性的表達質粒作為陽性對照來監測轉染效率和染色操作，并且要分別設單轉染和共轉染孔來方便一種蛋白影響另一種蛋白表達時的結果分析，所以轉染的時候一共要設以下孔：①ProteinA-V5；②ProteinB-MYC；③ProteinA-V5+ProteinB-MYC；④Positive-V5；⑤Positive-MYC。

因為細胞分得較稀，所以對于轉染試劑的毒性也會更加敏感，所以有時候有必要將轉染試劑和質粒減量。

4.轉染完成大于24--48h后，固定用PBS將細胞洗3遍，每遍 5min，如果細胞貼壁不牢（如HEK293）或者是半貼壁細胞（如 PC12），應該將12孔板傾斜，將PBS從低處緩緩加入，再平放，以免使細胞脫片。然后加入4%多聚甲醛固定液（如果細胞貼壁不牢，必須以同樣的輕柔方式），室溫固定10--15min，如果細胞貼壁不牢（如HEK293PC12），應該將12孔板傾斜，從低處緩緩加入，再平放，以免使細胞脫片。過長時間的固定會影響蛋白的免疫原性，對于細胞來說10--15min的固定已經足夠。

5.用PBS將細胞洗3遍，每遍5min

方法同前

6.細胞透化

室溫下，0.5% TritonX10/PBS透化處理10min。時間過長或者強度過高的透化有可能會破壞細胞的膜結構，對于細胞來說我們提供的透化已經足夠用于全細胞染色。

7.用4℃預冷的PBS將細胞洗3遍，每遍5min

8.封閉

以3% BSA/PBS封閉，37℃，30min或4℃ 過夜。這里我們推薦37℃，30min。此步主要用于封閉非特異蛋白質結合位點。也可以使用正常的鼠、兔、羊等與抗體相對應的正常血清作為封閉劑，使用的時候要進行適當的稀釋。

9.PBS將細胞洗一遍

方法同前。如細胞易脫落也可以不洗。

10.一抗孵育

在每孔中加入50μl以PBS按一定的稀釋度稀釋的一抗。（一般參考抗體說明書上推薦的濃度，例如Invitrogen公司的V5抗體，我們使用1∶10耀1∶20的稀釋度；如果進行雙免疫熒光分析則可以同時加入兩種一抗。）在蓋玻片上蓋一層封口膜（15ml離心管在封口膜上扣下的印跡可以作為裁剪封口膜的邊界），于濕盒中，37℃，30min或者4℃過夜。4℃過夜的一抗孵育有利于抗體和抗原蛋白充分結合，這里推薦大家使用4℃過夜作為一抗孵育的實驗條件。

當然也可以使用多加抗體稀釋液的方法，但是這樣比較浪費抗體。事實上4℃過夜孵育用過的抗體還可以被回收使用，這種方法在商品化抗體價格高昂的情況下還是有一定實用價值的，不過關鍵實驗中不推薦。

11.用4℃預冷的PBS將細胞洗3遍，每遍5min，洗去多余的一抗

方法同前

12.二抗孵育

在孔中加入50μl以PBS按1∶50稀釋的熒光素標記的二抗（選用中杉抗體作為參考，如果進行雙免疫熒光分析則同時加入兩種二抗），在蓋玻片上蓋一層封口膜，濕盒中，37℃，30min（推薦）或者4℃過夜。一般來說二抗還可以稀釋以取得更加特異的染色效果。

13.用4℃預冷的PBS將細胞洗3遍，每遍5min方法同前

14.雙蒸水將細胞洗3遍，每遍5min

15.如果需要染核，在細胞上滴加DAPI工作液，如果不需要，可直接進行乙醇漂洗如果細胞貼壁不牢（如HEK293PC12），應該將12孔板傾斜，從低處緩緩加入，再平放，以免使細胞脫片。

16.甲醇漂洗

17.乙醇漂洗

18.用針頭將在乙醇中的玻片撬起一側，用鑷子將玻片取出放在濾紙上晾干

19.封片：取8μl封片劑滴在載玻片上，將蓋玻片有細胞的一面朝下封片。封片劑不能多加，否則玻片會滑動

20.待封片劑均勻分布于蓋玻片下，即可周圍用指甲油封住（指甲油也只能加適量）為了取得*的染色效果，有時候有必要將一抗、二抗進行梯度稀釋，再進行組合用來對細胞進行免疫熒光染色。例如，一抗：1∶50，1∶10，1∶20，1∶40；二抗：1∶10，1∶20通過這樣的方法得到的染色片在倒置熒光顯微鏡下信號清晰明亮、本底低、對比明顯，才能滿足激光共聚焦顯微鏡觀察的要求。因為激光共聚焦顯微鏡逐點掃描特定焦平面各點，所以在目鏡下弱的信號一般都很難被采集到。

另外細胞系需要注意的一點，在實際操作中和文獻報道中我們發現有可能兩種蛋白不能一起過表達，即共轉染的時候只能得到一種蛋白的過表達產物，這樣的情況下就無法使用這種方法。
53016-31-2     去乙酰基諾孕酯標準品    Deacetylnorgestimate    25mg
5297-17-6     氯琥珀酰單膽堿標準品    Succinylmonocholine Chloride    150mg
529-59-9     染料木苷標準品    Genistin    30mg
52-86-8     氟哌啶醇標準品    Haloperidol     200mg
528-58-5    氯化花青素標準品    Cyanidin Chloride    25mg
527-75-3    紅霉素B標準品    Erythromycin B    100mg
52-76-6     利奈孕醇標準品    Lynestrenol    20mg
5270-74-6    氯噻酮相關物質A標準品        10mg
52699-48-6     醋酸戈那瑞林標準品    Gonadorelin Acetate    50mg
細胞系