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近些年，生物制藥迅猛發展，法規要求“源于細胞培養的產品都必須確保無支原體污染"，制藥企業對支原體檢測越來越重視。
在快速檢測方法出現以前，傳統檢測方法時效性不足，因此只能“抓頭"和“顧尾"，但行業內在注重支原體檢測方法性的同時，對時效性的要求越來越高。如第四期所述：傳統的培養法和DNA染色法雖然有著自身的優點，但較長的檢測周期或靈敏度逐漸不能滿足行業快速發展的需求。
NAT方法從當前支原體快速檢測方法中脫穎而出，已經被美國藥典[1]、歐洲藥典[2]和日本藥典[3]收錄，并明確提到NAT方法在經過適當驗證后，可用于檢測方法補充或替代藥典方法進行放行檢測。國內的相關機構和也在這方面做了的研究工作。
此外，任何一種檢測方法的驗證都需要建立在方法適用性和方法優化的基礎之上。支原體檢測方法在IND階段和臨床階段沒有要求必須做到完整的驗證，但是BLA前必須做面驗證[9]。
需要強調一點，不管是歐洲藥典還是日本藥典，對NAT方法驗證都有提到：標準品可以是支原體菌株也可以是支原體核酸。
支原體核酸能夠被檢出。這一方面數據可由廠家提供證明也可以根據實際情況進行選材驗證；
非支原體DNA不會被檢出。一般選用系統發育關系比較近的革蘭氏陽性細菌來驗證，包括Clostridium（梭菌屬）, Lactoacillus（乳酸菌屬）和Streptococcus（鏈球菌屬）的細菌。但是在實際操作中，也會引入宿主細胞和實驗室常使用的表達菌株DNA進行專屬性驗證，以確認細胞基質不會干擾結果判定。此外，由于支原體檢測實驗和操作環境都有的人源DNA氣溶膠存在，因此，也建議引入人源DNA進行專屬性確認，來排除檢測結果假陽性。
檢測限
檢測限指能夠檢測到的樣品中的The Lowest目標支原體或核酸濃度，在設定濃度情況下進行陰性/陽性確認即可，不要求定量。從統計學角度要求95%檢測孔中能夠檢測為陽性的The Lowest支原體或拷貝數濃度即檢測限。
藥典NAT方法驗證中但是不限于使用如下支原體進行方法學驗證，包含了制藥領域原輔料、操作人員等潛在污染源的代表性支原體類型。
實際驗證中，一般建議選取自己工藝中可能引入的支原體類型進行驗證即可
如工藝中涉及血清使用，建議驗證精氨酸支原體和發酵支原體；
如果涉及貼壁細胞培養和胰酶使用，建議驗證豬鼻支原體；
如果涉及植物源原輔料，建議進行柑橘頑固病螺原體驗證；
生產工藝中人一直會參與實驗操作，因此口腔支原體、肺炎支原體和唾液支原體都建議做驗證。
對于每種支原體，需要在不同天，至少各做3個稀釋梯度的標準品，每個稀釋梯度做8個重復檢測或不同天各做 4個稀釋梯度，每個稀釋梯度做6次重復檢測，每個梯度的復孔數不低于24孔，以便統計學分析，并以95%陽性率結果進行檢測限確定。也可以進行前期摸索，確定一個大致陽性閾值點，然后在此濃度范圍附近進行檢測限確認，進而減少工作量。
耐用性
耐用性指當檢測方法參數有小的刻意變化時，檢驗結果不受影響的能力，為方法正常使用時的可靠性提供依據。耐用性的評估在方法開發階段就應該被考慮，比如試劑中Mg2+、引物和dNTP的濃度，核酸提取步驟的變動以及不同核酸擴增儀也是經常用來評估的對象。與此同時，也建議耐用性考察盡量包括樣品保存方式，以及不同人員操作數據，來盡可能的減少檢測偏差。
以上為支原體檢測方法的驗證內容。要替代藥典方法，還需要做靈敏度可比性研究，證明NAT方法的靈敏度不低于藥典現有方法，即不低于10 CFU/mL或100CFU/mL的靈敏度。有兩種方案可以用于可比性研究：
核酸檢測與藥典方法平行進行，檢測并分析支原體LOD濃度情況下的檢出率；
將NAT方法的數據與此前藥典方法驗證的靈敏度數據對比。此種情況下，所用標準品的標定及穩定性都需要有明確的文件支持。
支原體NAT方法作為定性檢測，其驗證內容相對定量檢測方法驗證來說較為簡單。但是從實質上看，驗證復雜程度更大，而且考慮到標準品的來源、標定、保存及稀釋檢測，本身就是一項復雜工作。
但是就像前面內容所提到，支原體NAT方法本來就不能追求一次性完成，在BLA前完成完整驗證即可。而且，支原體檢測的本質是盡早盡可能靈敏的發現污染，這種檢測不是通過一次性驗證能夠完成的，這是一項持續的過程，直到工藝步驟全部鎖定。
目前為止，已經有很多企業使用MycoSEQ完成了NAT的方法驗證工作，并已經用于產品的放行檢測。因此為MycoSEQ的使用積累了寶貴的經驗和實踐基礎。
