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人原代肝細胞(Primary human hepatocytes, PHH)一直被視為毒理學領域中先進的體外人體肝臟模型系統。然而，傳統的轉染方法對這些細胞的轉染性研究一直具有挑戰性。且隨著培養過程的展開，PHH往往會快速失去其典型的肝功能，這限制了進一步研究的深入。Lonza帶來的新研究旨在優化冷凍保存的PHH的解凍、轉染和培養程序，以期能夠持續保持其穩定性和肝細胞功能。研究中對轉染7天后的肝臟細胞進行了轉染效率和肝細胞功能的綜合分析，以分析這一優化過程的成效。
那么就讓我們來看看具體用到了哪些設備與程序，以及這7天的報告[1]吧!
01
設備
· 4D Nucleofector™ Core unit(Catalog# AAF-1003B, Lonza)
· 4D Nucleofector™ X unit(Catalog# AAF-1003X, Lonza)
02
試劑
· Cryopreserved Primary Human Hepatocytes(Catalog# HUCPI, Lonza)
· Hepatocyte culture media: HCM Bullet Kit(Catalog# CC-3198, Lonza)
· P3 Primary Cell 4D-Nucleofector™ X Kit L(Catalog# V4XP-3024, Lonza)
· Matrigel(Corning)
· Cleancap mCherry RNA(TriLink)
· CellTiter-Blue Cell Viability Assay(Promega)
· Human Albumin ELISA Kit(Bethyl)
· Cholyl-lysyl-flurescein(CLF) staining(Corning)
03
結果
使用EX-147程序，觀察到高達68%的DNA轉染效率。白蛋白分泌和細胞色素p450活性在轉染后24小時明顯可檢測到，但部分不能持續較長時間(數據未顯示)。因此，我們推薦EX147程序用于高效的短期DNA轉染。
使用DS-150程序，DNA的效率高達20%，mRNA的效率高達85%，并持續7天。轉染后24h細胞活力和白蛋白分泌略有下降，但隨著時間的推移逐漸恢復。與對照培養相比，CYP1A2、CYP2B6和CYP3A4活性在60%至80%之間。轉染的PHH形成復雜的、分支的膽管網絡。我們推薦DS-150程序，用于siRNA和mRNA的高效轉染，以及轉染后長期培養的中等水平DNA轉染。
04
結論
我們提出了在冷凍保存的PHH中高效表達DNA和mRNA的研究方案。通過Lonza的研究表明，使用DS-150方案后，轉染肝細胞的功能可高度保存7天。這一方案有助于使轉染人肝細胞能夠產生更復雜的長期體外肝臟模型。
