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Revvity小動物活體光學成像技術已在生命科學基礎研究、臨床前醫學研究及藥物 研發等領域得到廣泛應用，其中納米材料研究是該技術的重要應用方向之一近年來， 納米材料在生物醫學研究以及藥物研發過程中表現出極大的應用潛能，吸引了生物學 ，醫學，材料學等眾多交叉領域研究人員的關注。在小動物活體技術主要應用到以下領 域當中：1、納米探針的研發；2、納米藥物載體評價；3、納米材料生物相容性和安全 性評價。下面結合一些具體的實例進行闡述：
一.納米探針的研發
納米熒光探針作為一種新型的探針,它所的量子尺寸效應和小尺寸效應使其呈 現出的光學性質。與傳統的有機熒光染料相比,納米熒光探針具有較好的激發及發射 特性，可通過調整探針的大小和組成來進行控制，從而調整到用于小動物活體光學成像 的光學波段；同時，熒光強度高，穩定性強，壽命長以及生物相容性好等優點，使得納 米熒光探針在對病灶以及靶標的標記以及生物體內代謝分布研究中呈現出天然的優勢。
目前基于小動物活體成像技術開發探針的研究中，根據熒光納米材料不同主要包括 以下幾類：量子點，金屬納米粒子，上轉化納米材料，半導體聚合物納米材料等。下面 以量子點，上轉化材料以及半導體聚合物納米材料開發的探針為例子介紹小動物活體成 像技術的應用。
1．量子點
量子點是一種由元素周期表中Ⅱ-Ⅵ主族如CdSe,CdTe,Ⅲ-Ⅴ主族如InP,InAs等組 成的納米顆粒，直徑在1-100nm之間，能夠接受激發光產生熒光的半導體納米顆粒。量 子點的體積大小嚴格控制著它的光譜特征。量子點由于其量子尺寸效應，粒徑不同或組 成材料不同可發射不同顏色的熒光。該探針具有以下顯著特點：發射光譜窄，光譜重疊 明顯減小，該特性適合作為基于熒光共振能量轉移熒光探針的供體，相比較下，有機熒 光染料寬發射光譜帶來的紅端拖尾效應會造成供體受體發射光的重疊串擾；具有寬廣的 激發帶，而發射波長可以通過調整粒子徑的大小進行調節，有利于開展生物樣品多色標 記；具有較高的量子產率，較大的stokes位移，優良的穩定性以及抗光漂白能力。
Yaping Wang 等開發了一種MMP-2敏感性的納米探針，用以檢測MMP-2過表達的 腫瘤（Theranostics. 2015）。MMP-2（基質金屬蛋白酶-2）在大部分的實體瘤中都有檢 測到過量表達，比如乳腺癌，結腸癌，前列腺癌等。由于MMP-2在促進癌癥發展過程 中發揮重要作用，因此，它可以作為腫瘤診斷和治療的重要靶點。而該探針的原理是將 染料DSY21以及量子點通過MMP2的底物肽段（MMP2-cleavable peptide）連接，此時由于二者接近，FRET效應會抑制量子點產生熒光信號，而當探針進入MMP高表達的 相關腫瘤位點時，MMP2就會水解熒光基團之間的肽段，就會釋放出可以激發的功能性 量子點，已達到對MMP2的檢測（圖1）。
利用小動物光學活體成像技術，監測人纖維瘤細胞HT1080皮下瘤小鼠，人乳腺癌 細胞MCF7 皮下瘤小鼠，人膠質瘤細胞U87皮下瘤小鼠體內該納米探針在腫瘤部位以 及各器官中的分布情況。以皮下腦膠質瘤模型為例，U87體外培養細胞系的MMP-2表 達含量很低，但是在皮下瘤模型以及原位腫瘤中組織MMP-2含量卻很高（圖2E），表 明腫瘤細胞在體內形成會收到腫瘤環境的影響。將皮下異質瘤模型納米探針在1h后開 始聚集到腫瘤部位，并且熒光信號在隨后6h過程中逐漸升高（圖2A，2B）。24h后離 體檢測各主要器官以及U87腫瘤組織中的熒光強度（圖2C，2D）。結果顯示，在腫瘤 組織中檢測到熒光強度是最高的，表明該探針用于活體內腫瘤的檢測。
然而，腦腫瘤檢測一個重要的方面是要考慮探針跨越血腦屏障的能力，因此，本工 作又構建了原位膠質瘤小鼠模型。為了對腫瘤形成進行檢測，通過Luc標記的U87細 胞進行模型構建（圖3A左側）。在該探針上整合T7序列（腦靶向序列），用以提高 該探針在腦腫瘤部位的積累。結果顯示T7功能納米探針在1小時后在腫瘤部位開始積 累，并且熒光強度在10小時內逐步增強，并在22小時后逐漸消逝（圖3）。
量子點包含鎘或其他重金屬，即使在很低的濃度下還是有很強的毒性。因此，在開 發用于活體成像的量子點探針時，如何降低量子點的毒性也是主要考慮的問題之一。目 前新的替代產物也在逐步的開發出來，其中碳納米點，石墨烯納米點等低毒性納米材料 已經用于活體檢測當中。而且，量子點需要高能量的紫外或近紫外光激發，在采集熒光 探針信號的同時，生物組織在高能量光源激發下產生的自身熒光也會極大干擾熒光探針 的信號，造成信噪比變差，從而不能檢測深層生物組織的信號。
2．上轉化納米材料
稀土離子上轉換發光材料是一種在近紅外光激發下能發出可見光的發光材料，即可 通過多光子機制把長波輻射轉換成短波輻射，所以稱之為“上轉換"。其最大的特點是 材料所吸收的光子能量低于發射的光子能量。
熒光上轉換納米粒子吸收兩個或兩個以上的紅外光子，發射一個可見光子或近紅外 光子。通過改變摻雜離子度，可以實現從紫光到近紅外的發光調控。與量子點和有機熒 光染料相比，熒光上轉換納米材料具有化學穩定性好、熒光量子產率高、毒性低、不會 產生背景熒光、信噪比好等特點。最重要的是，熒光上轉換納米粒子的激發光為紅外光 （常用808nm，980nm），這個波段的光在生物組織和血液中的吸收極低，是人體的透明窗口，因此可以用于檢測更深層的生物組織情況，且不會對生物組織產生光損傷。此 外，紅外激光器小巧緊湊、功率高、價格低廉，為熒光上轉換納米粒子的實際應用提供 了良好的條件。以上這些優點使得熒光上轉換納米粒子在生物分析，特別是在生物體內 成像上有著廣闊的應用前景。
Liyuan Pan 報道了小尺寸、高熒光信號強度的上轉化納米探針，用來對活體內胃腫瘤進 行靶向標記（Theranostics.2013）。如圖 4，首先通過反應以 SiO2 納米材料包裹上轉化材 料NaYbF4: 25%Gd, 2%Tm ，用以增加該材料的組織相容性；之后，通過氨基官能團將葉酸 FA 連接到材料上，從而合成用于特異性識別葉酸受體的納米探針。
葉酸受體（Folate Recetor）是一種細胞膜上的糖蛋白，在正常情況下只在胎盤組織， 腎小管等中有少量表達，但是在許多惡性腫瘤中，受體的表達數量以及活性都遠遠超過 正常水平。因此，可以將它作為腫瘤的標志物。通過小動物活體成像技術可以檢測該納 米探針對胃癌的靶向作用。首先裸鼠皮下接種胃癌細胞MGC803，待到腫瘤組織生長到 5mm 后，尾靜脈注射UCNP-FA熒光探針（圖5A），并同時注射未連接FA的材料作 為對照（圖5B）。然后，通過外接激光器進行激發，并利用小動物活體設備進行檢測。 結果發現，UCNP-FA熒光探針具有很好的生物學靶向作用。
在上轉化材料用于活體成像研究中，由于涉及到外置激光器，因此，儀器整合的同 步性，安全性方面都是研究過程中需要考量的重要因素。
3．復合型納米探
有機半導體聚合物是一類因共軛電子而產生半導體性質的高分子材料,在高靈敏的 化學和生物傳感器領域獲得了廣泛應用 。半導體聚合物具有光學吸收截面大、熒光量 子效率高、輻射躍遷速率快等特性,這些優異的光學性質特別適合于開發生物應用方面的 納米熒光探針。這些小尺寸高亮度的納米材料可以通過表面功能化與生物分子偶聯,從而 在生物醫學應用中發揮重要作用。
Shuhendler 等報道了一種納米探針，可以實時的同時監測小鼠肝內部的活性氧 （ROS）以及活性氮（RNS），從而對藥物的急性肝毒性進行評價（Nat Biotechnol. 2014）。 藥物毒性是現代藥物研發過程存在已久的問題，而其中藥物導致的肝毒性是影響藥物上 市的一個最重要的因素。因此，在臨床前實現對藥物肝毒性的監測，能夠在藥物研發的 初期盡量降低肝毒性，大大提高藥物研發的成功性并且降低研發成本。ROS 以及 RNS 可以作為藥物安全性評價的標志物：ROS（包括 H2O2）可以通過藥物代謝過程中的 I 型氧化酶直接產生，或者間接通過自由基藥物代謝產物與氧發生反應產生；藥物代謝過程 中，電子傳遞鏈的斷裂會造成線粒體毒性，進而導致RNS的產生。由于ROS以及RNS生 成來源不同，對它們的同時監測能夠更加全面地反映肝毒性機制，從而可以對藥物的毒性作 出更加精確的評價。
這種探針將兩種探測元件整合到半導體聚合物納米熒光材料上（CPN）（圖6A）： H2O2敏感的化學發光底物通過化學發光共振能量轉移（CRET）導致CPN發光，該模式 不需要外源光的激發；另外，激發 CPN 材料通過熒光共振能量轉移至可氧化降解的熒 光染料，并通過發生共振轉移的熒光比率來對ONOO?進行檢測，該模式需要外源光的 激發。這種將 CRET 以及 FRET 整合到 SPN 上的這種探針稱為 CRET-FRET-SPN (CF-SPN)，該探針中納米材料CPN在CRET中作為光受體，而在FRET中則作為光供 體（圖6B）。另外，在 CF-SPN 上連接了乳糖殘基，會靶向性的結合到肝細胞竇狀隙 膜上表達的非唾液酸糖蛋白受體，以實現該探針對肝器官的定位（圖6A）。通過IVIS 的生物發光以及熒光成像功能，可以為該探針的兩種檢測模式提供完善的監測解決方案。
為了驗證 CF-SPN 的效果，我們利用退燒藥 APAP 誘導的肝毒性模型進行檢測。 APAP 誘導肝毒性的機制已經研究的很清楚了，主要是由于I型藥物毒性代謝途徑。過 量的APAP誘導生成過量的ROS以及RNS，從而產生氧化和氮化壓力。隨后，關鍵的 細胞抗氧化劑GSH的消耗會啟動一系列的信號反應，導致細胞的壞死。通過尾靜脈注 射APAP，15min后注射CF-SPNs后即時進行持續的生物發光以及熒光圖像采集（圖7A）。 結果顯示，18min的化學發光圖顯示在一個APAP過量劑量(300 mg/kg)的情況下，光信 號有一個顯著的增強過程；然而在低劑量(75，150 mg/kg)情況下，光信號的強度與對照 組的強度相近（圖 7B）。這種閾值劑量型的毒性特性（比如，低于關鍵毒性劑量的劑 量非依賴性特征）與APAP誘導肝毒性的機理是一致的。熒光圖片結果顯示出與生物發 光類似的閾值劑量型毒性，不過這種信號在53min后才顯示出了明顯的差異性（圖7C）。 這個結果說明了APAP過量誘導的ONOO?生成要晚于H2O2的產生。
之后，根據以上模型的結果，又利用CF-SPN檢測了另外一種廣泛使用的化療藥物 INH 誘導的肝氧化和氮化壓力。INH在3%-13%的病人中表現出了肝毒性，但是相關的 機制還不是很清楚。通過尾靜脈注射INH，15min后注射CF-SPNs后即時進行持續的生 物發光以及熒光圖像采集。結果顯示，與APAP閾值型毒性不同，INH在H2O2的產生 上表現出閾值劑量型，而在ONOO? 的產生中表現出劑量依賴型。而且，氧化壓力以及 氮化壓力的動力也顯著的不一樣。INH誘導了更加快速短暫的氧化激增，之后會快速的 回復；而誘導的氮化壓力表現出緩慢且持續的增長（圖8）。
因此，這種利用CF-SPN對藥物肝毒性誘導的氧化和氮化壓力的持續監測，可以使 用于各種類型的藥物生物反應機制，并且可以通過不同的動力學表現特征將它們區分開 來。而要實現這一檢測的前提，除了納米探針的巧妙設計之外，還需要小動物活體光學 成像技術的支持。不僅能夠實現高品質生物發光以及熒光的檢測，同時，可以對小動物 進行連續持續的動力學檢測。
另外，除了以上基于本身有熒光特性的納米探針之外，利用能夠裝載有機熒光染料 的納米載藥系統也可以作為納米探針進行使用。而這種改造大大提高了原有機熒光染料的穩定性，持續性以及光學特性。這一部分工作在以下納米藥物載體部分進行相應闡述。
二.納米藥物載體研究
納米藥物載體已經成為國內外醫藥學研究的重要領域。納米載藥系統相對于傳統藥 物展現出巨大的優勢：首先，納米載藥系統可以通過連接的特異性化合物，多肽，抗體 等基團提高藥物的靶向性；其次，納米藥物載體可以通過細胞內吞等機制而非跨膜轉運 機制進入細胞，大大提高了藥物生物膜的透過性，從而提高細胞內有效的藥物濃度；再 次，藥物靶向性的提高以及生物膜通透性的增強，就相對降低了非有效作用部位藥物的 濃度，藥物的毒副作用相應會降低；另外，納米緩釋特性以及高度分散性，也提高藥物 的時效性以及利用率。
應用小動物活體成像技術對納米藥物載體的研究，主要是對納米藥物載體在小動物 體內分布特性以及靶向性評價，用以評價藥效的提高以及毒副作用。該技術可以通過兩 個方面來研究納米載藥系統：通過對疾病細胞進行熒光或者生物發光標記，觀測納米藥 物載體對藥物藥效的提高；通過直接對納米載藥系統進行熒光標記，觀測納米藥物載體 在動物體內分布以及定位情況。下面我們以納米藥物載體提高阿霉素Doxorubicin 對腫 瘤的藥效以及靶向性研究為例對這兩種方式進行闡述。
Rong Xu 等開發了一種可注射納米粒子發生器，能夠在小鼠的肺轉移瘤內生成納米 粒子，從而治療肺轉移性腫瘤（Nat Biotechnol.2016）。該研究從突破體內生物屏障角 度出發，創新性構建了新型納米藥物iNPG-pDox。與傳統化療藥物阿霉素僅能穿透細胞 膜單一生物屏障相比，設計使 iNPG-pDox 能突破體內多種生物屏障，高效靶向 乳腺癌的肺轉移瘤。
該納米藥物iNPG-pDox由裝配多鏈聚合物（pDOX）的納米多孔硅材料組成，而每 條單體鏈都含有阿霉素。一旦進入腫瘤，硅材料就會降解，釋放出單體鏈。由于自然動 力學力量，這些鏈就會形成可以被癌細胞吸收的納米粒子（pDOX NP），被內吞進入細 胞核周酸性區域。聚合物上鏈接阿霉素的PH值敏感的連接基團斷開，釋放出阿霉素，從而大大提高藥物進入細胞的濃度（圖9）。納米藥物的每個部件在突破不同生物學屏 障過程中發揮不同的作用（圖10）。
為了觀察納米藥物對肺轉移腫瘤的效果，利用生物發光標記的轉移性 MDA-MB-231 細胞構建肺轉移模型，從而比較納米藥物相對于相同量傳統藥物對癌細 胞肺轉移的抑制情況。結果顯示，納米藥物iNPG-pDoX相對于傳統的DOX來說展現出 更好的治療效果（圖11）。
之后的生存數據進一步驗證了這一結果，在接受該藥物治療的小鼠當中，有50%的 小鼠在八個月后沒有出現轉移性疾病的跡象（圖12）。這相當于人類轉移性疾病約24 年的遠期生存。這種新的藥物可以幫助醫生治療其他來源的肺轉移癌，以及原發性肺癌。
小動物活體成像技術保證了對疾病模型小鼠長達8個多月的持續性檢測，極大的降低了實驗成本，提高了實驗的準確性。反映了納米藥物載體相對于傳統藥物在靶向作用 以及療效上展現出了巨大的優勢。除此之外，利用熒光標記藥物則可以對納米藥物載體 進行示蹤，從而更加直觀的觀測靶向作用以及生物體內分布情況。
Hai Wang 等則在納米藥物載體上連接了熒光染料，從而可以對這一治療性納米藥 物進行監測（Nat Commun. 2015）。他們開發了一種強大的仿真核細胞納米載藥系統用 以裝配治療和診斷試劑，從而精確的控制藥物的運輸。
該仿真核細胞載藥系統LC60S 由富勒烯（C60），介孔氧化硅以及磷脂（DPPC） 組成，具有很好的真核細胞結構，包括磷脂膜（DPPC），細胞骨架（介孔氧化硅）和 細胞核（C60）（圖13）。
利用該載藥系統可以同時裝載ICG以及DOX，從而實現對腫瘤的靶向治療以及對 該納米材料實時監測的雙重功能。結果顯示，在注射后2h，三種含有ICG成分藥物注 射的小鼠全身都可以檢測到ICG熒光。然而，重要的是在只有LC60S-DI組小鼠的腫瘤 區域觀測到較強的熒光，而且該熒光強度在4-6小時后逐漸增強；而與之相反，DOX&ICG 或 C60S-DI 組小鼠的腫瘤區域則沒有 ICG 熒光信號。并且，28 小時后仍然可以在 LC60S-DI 組小鼠中監測到ICG熒光（圖14a）。為了進一步驗證，28小時后將各個器官以及腫瘤進行離體熒光檢測，同樣顯示只有LC60S-DI的腫瘤中檢測到熒光（圖 14b）。通過對血液中ICG熒光進行檢測發現：游離ICG快速從血液循環中消逝，2小 時以后熒光強度下降70%；血液中C60S-DI的代謝速度也是一樣。而與之相反，LC60S-DI 納米材料血液中仍然可以檢測到很強的熒光強度，而且在8小時以后的熒光強度也在初 始的一半以上（圖 14c，d）。這些結果表面， LC60S-DI 納米材料在體內有更長的半 衰期，并具有更加符合藥物傳輸的納米材料特性。
該工作充分體現了小動物活體成像技術的優勢，不僅可以對活體進行實時觀測，還 可以對離體器官以及血液體液中藥物濃度進行檢測。從而，實現對納米藥物的多方面研 究需求。而該技術在對納米藥物載體示蹤研究中已經極為成熟。
Changying Shi 等也做了類似的工作（Nat Commun. 2016），利用線性分枝狀聚合 物構建納米藥物載體，并利用該載體裝載的 DOX-2nd GNP 相對于 Dox 以及 Doxil® （DOX脂質體）對淋巴瘤具有更好的治療效果（圖15）。
三.納米材料生物相容性和安全性評價
與其他應用于生物學活體研究一樣，納米材料進入機體，穿過生理性屏障以及靶向 特定部位的這些過程都與材料的生物相容性密切相關。不管是在納米探針開發還是在納 米藥物載體的構建過程中，組織相容性都是需要考慮的重要方面。以前文為例，量子點 探針中的LMWP，上轉化探針中SiO2納米材料，納米藥物iNPG-pDox中的聚合物以及 LC60S 納米載藥系統的類真核細胞設計都是納米材料生物相容性考慮的直接體現。因 此，這里就不再進行贅述.
而所有納米材料作為活體研究工具，都需要進行安全性評價，其中肝毒性評價實驗 通常被用來進行材料以及藥物毒性評價。下面以軍事醫學科學院的研究為例，Zhang Y 等構建了肝臟急性炎癥反應模型，可以用來評價納米材料的肝毒性（Small.2016）。
納米金作為一種常見的高組織相容性納米材料，廣泛應用于疾病的診斷和治療當 中。最近越來越多的研究表明，納米金注射到動物體內以后，會在肝臟和脾臟中積累。 而在這些免疫細胞富集的區域，這種積累會造成一系列的局部或者全身炎癥反應。急性 期蛋白SAA主要分布于肝細胞中，在急性炎癥反應中表達量水平上升了1000倍，因此 可以作為急性炎癥反應模型。通過水動力高壓轉染并且結合噬菌體整合技術建立肝臟 SAA長期穩定表達模型，可以對肝臟SAA進行連續、動態、實時監測，并用LPS進行 驗證（圖16）。
應用該模型發現納米金因形貌和粒徑的不同激活SAA表達程度的差異。以4~6周 齡雄性Balb/c 小鼠為模型，尾靜脈注射 GNP10，GNP30，GNP50，GNP80（不同納米 尺寸），GNRs，GNCs等6種納米金材料，分別在注射材料前，注射后4h/8h/12h/24h/48h 進行活體生物發光檢測成像監測。結果發現，GNP50球形金顆粒會激起機體急性 炎癥反應(圖17)。
為了研究該激活途徑的具體機制，用類似的NF-κB模型小鼠進行研究。結果表明 GNP50 能夠激活NF-κB通路，這種激活過程可以被NF-κB抑制劑PDTC所阻斷。進 一步發現GNP50 誘導SAA激活的過程可以被PDTC所抑制，證明該效應是通過NF κB通路激活的（圖18）。
四.總結
納米材料的研究已經越來越頻繁的使用小動物活體成像技術。它在各種類型的熒 光，化學發光探針的檢測方面展現出了極大的兼容性；同時，對于納米藥物載體的評價 以及毒性的評價方面也表現出極大優勢。今后，隨著納米技術與生物醫學研究的進一步 融合，小動物活體成像必將在這一領域發揮越來越重要的作用。
