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Revvity小動物活體光學成像技術已在生命科學基礎研究、臨床前醫學研究及藥物 研發等領域得到廣泛應用。在眾多應用領域中，腫瘤研究是目前應用最為普遍的領域之 一。常用于腫瘤活體成像的光學標記方法包括：1、利用螢火蟲熒光素酶（Firefly Luciferase）或熒光蛋白作為報告基因，通過轉基因技術體外標記腫瘤細胞而直接觀測腫 瘤的發展變化，或標記特定基因而研究腫瘤相關基因在腫瘤發展中的作用；2、通過外 源注射功能性熒光探針，觀測腫瘤發展過程中的分子事件，進而反映腫瘤的發展變化。 宏觀來說，應用小動物活體光學成像技術進行腫瘤研究主要集中于三個方面：1、長時 間監測腫瘤生長及轉移；2、抗腫瘤藥物研發；3、癌癥分子機理研究。下面結合一些具 體實例進行闡述：

一. 長時間監測腫瘤生長及轉移

隨著腫瘤研究的深入，應用傳統方法（如卡尺測量腫瘤體積、腫瘤組織切片等）進 行腫瘤研究已存在諸多限制。如進行組織切片觀測前需要處死小鼠取出腫瘤組織，因此， 在不同時間點或不同實驗組都需要處死一批實驗小鼠以獲取足夠的統計學數據，這樣不 但大大增加了實驗成本，而且很難消除由于小鼠個體差異而產生的誤差，無法獲取可靠 的重復性數據，同時，在制作切片時也無法保證實驗的準確性，而利用活體光學成像技 術可以對同一批小鼠進行不同時間點的長時間觀測，進而大幅降低實驗成本，并獲取重 復可靠的實驗數據；

又如通過利用卡尺測量腫瘤體積的方法，只能等腫瘤發展至可以測量的程度才能開 展實驗，因此，無法進行腫瘤早期觀測及微小轉移灶的觀測，而利用靈敏的生物發光成 像技術在腫瘤發生早期即可進行有效觀測，從而對腫瘤的整個發展過程進行全程監測， 有力彌補了傳統方法的缺陷。下面幾個例子展示了應用生物發光成像技術長時間監測腫 瘤的生長及轉移。

二.抗腫瘤藥物研發

Revvity的小動物活體光學成像技術已廣泛應用于腫瘤治療藥物的臨床前研發階段 ，發揮越來越重要的作用。全球各大制藥企業均已采用活體光學成像技術開展抗腫瘤新 藥的研發，其中已有6種藥物獲得FDA認證，另有8種藥物處于臨床測試階段。

應用小動物活體光學成像技術進行新藥研發，主要包括以下方面：1、在活體動物 水平進行藥效評價；2、觀測藥物在活體動物體內的靶向、分布及代謝。 1、藥效評價 利用熒光素酶標記腫瘤細胞，并移植入動物體內建立腫瘤疾病動物模型，應用小動 物活體光學成像技術觀測給藥后腫瘤光學信號的變化情況，進而評價不同藥物、特定的 給藥途徑、時間、劑量等給藥策略對于腫瘤的治療效果，如下圖：

相對于觸診、腫瘤體積測量等傳統方法，利用高靈敏度的生物發光成像技術進行藥物評價，可以更靈敏的發現殘余病灶點或盡早發現腫瘤的復發，從而更準確的對藥物治療效果進行判定，如下例：

利用生物發光成像技術進行藥效評價的另一優勢在于，可以明確判斷藥物是否 有效殺死腫瘤活細胞。這是由于生物發光的原理是基于活細胞環境的酶促反應，因此， 能夠發光的細胞必定是具有活性的。下圖所示為輝瑞公司抗腫瘤藥物Sutent的部分研究 結果，研究人員首先利用卡尺測量腫瘤體積的方法觀測該藥物對于腫瘤的生長抑制情 況，發現該藥物能夠延緩腫瘤的生長，但體積測量數據顯示腫瘤并未變小，研究人員隨 后利用生物發光成像技術進行觀測，發現給藥一定時間后腫瘤光學信號顯著降低，說明 該藥物對腫瘤活性細胞確實具有殺傷作用，同時說明單獨依靠腫瘤體積測量的方式無法 準確真實反映藥物治療效果。憑借活體光學成像的實驗結果，Sutent得以順利通過FDA 的認證。

除了應用生物發光技術研究藥物對于腫瘤的治療效果之外，熒光成像技術同樣可以 應用于此類研究，主要方式為通過外源注射功能性熒光試劑觀測藥物對于腫瘤某一方面 的治療情況，如利用反映血管生成的熒光試劑觀測藥物對于腫瘤血管新生的抑制情況， 又如利用反映細胞凋亡的熒光試劑觀測由于藥物治療而誘發的腫瘤細胞凋亡情況。

2、觀測藥物靶向、分布及代謝

除了在藥效學中的應用，小動物活體光學成像也廣泛應用于藥物在體內靶向、分布 及代謝的研究。與藥效學中的應用不同，此類應用是以藥物為直接觀測對象，因此標記 方式通常是利用熒光探針直接標記藥物本身，通過追蹤熒光信號而反映藥物在體內的分 布情況。 例如在研究抗體或多肽類藥物是否能夠有效靶向腫瘤的實驗中，可以利用熒光染料通過化學鍵的結合標記目標抗體或多肽，經尾靜脈注射后，利用小動物活體光學成像系 統觀測上述標記對象的腫瘤靶向性，如下圖：

事實上，直接通過熒光染料標記藥物注入體內的方式存在諸多問題，如低靶向性、 低藥效性、免疫排斥、藥物毒性問題等。因此，構建新型藥物載體也是目前藥物研究的 熱點之一，應用小動物活體光學成像技術同樣可以在這一領域發揮作用。如下圖所示為 研究人員通過小動物活體光學成像技術觀測一種新型納米共聚物給藥載體在體內運載 嗎啉基反義寡核苷酸靶向治療腫瘤的實驗。此類給藥載體包含多種組分，如起整體保護 作用的外層多聚蘋果酸骨架及聚乙二醇、起腫瘤靶向作用的抗體連接組分、藥物釋放組 分、熒光染料結合位點等。結果表明，通過應用新型納米給藥載體可以有效提升藥物的 靶向治療效果。

在研究藥物靶向的同時，了解不同時間點藥物在動物體各個器官的分布及最終代謝 情況同樣。Revvity的FMT小動物活體熒光斷層成像系統可以很好的滿足此類應用需求。應用FMT成像系統，能夠對熒光標記的藥物在深層器官的分布進行斷 層掃描及三維重建，獲得真實準確的三維定量數據，進而對藥物的體內分布代謝情況作 出正確分析。如下圖

應用活體熒光成像技術進行藥物分布的觀測目前主要局限于對生物大分子藥物的 研究，而對天然或化學小分子藥物的分布代謝研究主要依靠的是放射性核素標記成像 （PET 或 SPECT），原因是用相對大分子量的熒光染料標記小分子藥物，則熒光染料 本身即會對小分子藥物在體內的分布代謝產生影響，因此無法將活體熒光成像技術應用 于此類研究。然而，科研人員最近發現應用高靈敏度的 IVIS 活體光學成像系統可以觀 測到放射性核素在小鼠體內發出的光學信號，其所依據的是切倫科夫輻射（Cherenkov Radiation）原理，由此拓展了活體光學成像技術的應用范疇，即利用活體光學成像系統 觀測經放射性核素標記的小分子藥物在體內的分布代謝。

三.癌癥分子機理研究

對于癌癥分子機理的研究之前一直局限于體外水平，體外研究的缺陷在于無法模擬 腫瘤在動物體內真實的生理微環境，因此，單一的體外研究結果并不能反映癌癥的 發生發展機理。小動物活體光學成像技術使科研人員能夠進一步將癌癥分子機理的研究 由體外拓展至體內，如在活體動物水平研究癌癥相關基因在癌癥發生發展進程中的作 用、觀測腫瘤發生發展過程中特異性分子事件的發生等。

1、應用生物發光技術研究癌癥相關基因的作用

應用生物發光技術進行癌癥相關基因的研究方法，主要利用熒光素酶標記特定基 因，構建特定基因-熒光素酶的共表達載體，通過熒光素酶產生的生物發光信號反映該 基因的表達情況，研究該基因的相關作用。以下幾個例子是應用生物發光技術研究癌癥 相關基因在不同腫瘤模型中作用： p53 是調節細胞正常生命活動的一種重要基因，控制著細胞周期的啟動。p53 也同 時被認為是一種重要的抑癌基因，在人類50%以上的腫瘤組織中均發現了p53基因的突 變，這是腫瘤中最常見的遺傳學改變，說明該基因的改變很可能是人類腫瘤產生的主要 發病因素。下圖所示是發表于2007年Nature雜志上的一篇研究p53抑癌作用的文獻結 果。研究者將一個同時帶有致癌基因ras、四環素反式激活因子tTA (‘tet-off’)及四環素 依賴性p53 shRNA 的逆轉錄病毒表達載體與熒光素酶基因質粒共轉染從小鼠胚胎提取 的成肝細胞，并將轉染細胞接種于小鼠肝臟，觀測p53基因表達關閉或開啟對于肝癌發 生或消亡的作用。結果顯示，當p53的表達被shRNA抑制時，通過生物發光觀測到的 腫瘤信號逐漸增強，而當給小鼠注入強力霉素（doxycycline）開啟p53的表達后，肝癌 細胞的生物發光信號逐漸減弱，說明p53的表達能夠抑制腫瘤的生長并促使腫瘤消亡。

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，而乳腺癌轉移是導致患者死亡的主要原因， 乳腺癌轉移的分子機理目前還不清楚。LSD1是第一個被發現的組蛋白去甲基化酶， 理論上對基因轉錄起廣泛調控作用，但近期研究卻表明LSD1只參與一些特異的細胞信 號通路的調控而且與多種腫瘤的發生發展高度相關。北大醫學部尚永豐教授課題組應用 IVIS 活體光學成像系統觀測到LSD1能抑制乳腺癌的侵襲和轉移，從而揭示了LSD1這 一表觀調控因子在抑制乳腺癌轉移中的重要作用，并為乳腺癌轉移的干預提供了新的分 子靶點。上述結果發表于2009年Cell雜志。

腫瘤細胞生長、轉移和復發的特點與干細胞的基本特性十分相似，因此，有學者提 出腫瘤干細胞（Cancer\Tumor Stem Cell, CSC\TSC）的理論。腫瘤干細胞可以長時間處 于休眠狀態并具有多種耐藥分子而對殺傷腫瘤細胞的外界理化因素不敏感，導致腫瘤往 往在常規治療方法消滅大部分普通腫瘤細胞后一段時間復發。因此，如果能夠尋找到腫 瘤干細胞特異性治療靶標，將為腫瘤治療開辟新的路徑。OCT4是參與調控胚胎干細胞 自我更新和維持其全能性的最重要的轉錄因子之，因此，OCT4可能是殺傷腫瘤干 細胞的潛在靶點之一。下述實驗是應用IVIS系統觀測OCT4在乳腺癌細胞成瘤中的作 用。研究者將帶有OCT4基因的載體轉染經熒光素酶標記的鼠源乳腺癌細胞株4T1-luc， 并分選出高表達及低表達OCT4基因的細胞株，分別原位接種于小鼠胸部乳腺脂肪墊， 觀測結果顯示OCT4高表達乳腺癌細胞株具有更高的成瘤性。

2、應用功能性熒光試劑觀測腫瘤內部特異性分子事件的發生

腫瘤發展進程中伴隨著諸多分子事件的發生，如某些蛋白酶的表達特異性升高、某 些表面標識物的特異性表達、腫瘤周邊血管的新生、腫瘤組織局部缺氧等，通過觀測這 些分子事件能夠判斷腫瘤的發展程度并作出預后。Revvity提供了一系列應用于腫瘤研 究的功能性熒光試劑，使上述觀測成為可能。以下為具體應用實例：應用PSA 750 FAST酶激活類熒光試劑觀測PSA+前列腺腫瘤

前列腺特異抗原(Prostate Specific Antigen，PSA) 主要是由前列腺上皮細胞產生的 蛋白分解酶，正常情況下被分泌入前列腺液或精液中以有活性的游離形式存在，血清中 的 PSA 主要以結合形式存在。正常及良性前列腺增生的前列腺上皮均可分泌游離或結 合形式的PSA，但具有酶活性的PSA只存在于惡性前列腺腫瘤中。PSA 750 FAST是一 種只能被具有酶活性 PSA 特異性激活的熒光試劑，因此可用于監測前列腺腫瘤的惡性 程度。

應用IntegriSense 及 ProSense 熒光試劑觀測腫瘤血管新生及組織蛋白酶的表達

腫瘤的發生發展伴隨著諸多分子事件的共同發生，應用不同種類的熒光試劑，可以 實現在一個實驗中觀測腫瘤內部的多個生物學進程。如下圖所示，在一個實驗中同時利 用IntegriSense 及 ProSense 兩種熒光試劑對腫瘤進行觀測：應用IntegriSense750靶向類 熒光試劑可以靶向監測腫瘤血管上皮特異性表達的整聯蛋白αvβ3而反映腫瘤的血管新 生；而應用ProSense680酶激活類熒光試劑能夠監測腫瘤細胞中組織蛋白酶的活性，進 而揭示兩種對象在腫瘤內部的不同分布及藥物（Avastin）治療后的不同變化。

應用HypoxiSense 及 AngioSense 熒光試劑觀測腫瘤微環境

腫瘤的發生和轉移與腫瘤細胞所處的內外環境有著密切關系，了解腫瘤微環境對于 腫瘤的診斷、防治和預后有著重要意義。下圖所示為利用監測腫瘤組織缺氧的 HypoxiSense 靶向類熒光試劑與監測腫瘤血管生成的AngioSense血管生理類熒光試劑共 同觀測小鼠皮下接種的人宮頸癌腫瘤微環境。其中，HypoxiSense 能夠特異性靶向缺氧 腫瘤細胞表面上調表達的碳酸酐酶9（CAIX），進而表征腫瘤的缺氧區域；而AngioSense 通過富集于由于腫瘤血管新生而引發的血管滲漏區域，進而表征腫瘤的血管富集區域。 定量結果顯示缺氧部位主要位于腫瘤內部中心區。