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Beacon®單細胞光導系統與Opto® B Discovery抗體發現試劑盒讓研究人員能夠在一周內從多個物種中發現和篩選出功能性候選抗體（圖1）。為生物制藥企業、科研實驗室和CRO的研究人員提供抗體藥物早期發現工具。Beacon®高通量的單B細胞抗體發現方式可能會在初期識別出數百至數千個抗原結合抗體。研究者可以利用OptoSelect芯片上的多輪篩選提高聚焦度。如果只是基于結合實驗進行隨機選擇，往往需要重組表達眾多的抗體候選分子（hits），再經歷重組表達和大量的驗證后才能縮減到少數進入下游的先導抗體（leads）。

布魯克細胞分析的研發團隊基于現有的結合檢測，開發出Beacon親和力評分（Beacon Affinity Score）分析方法，在抗體篩選初期就能夠完成對上萬個抗體的親和力評估。通過對在納摩爾至皮摩爾范圍親和力的結合抗體進行排序，讓使用者不再隨機選擇hits，而是根據親和力排序選擇潛力的候選序列進行下游驗證。這將在不增加額外成本的情況下，幫助科學家增加評估維度，減少后續驗證壓力，提升功能抗體開發的成功率。此外，Beacon®平臺生成的大量數據為人工智能和機器學習的模型優化添磚加瓦，或將帶來抗體工程和抗體開發領域革命。

圖1.利用Opto® B Discovery親和力分析開展抗體發現。在一周內實現從多種物種B細胞無損克隆、功能優先的單B細胞篩選（包括相對結合親和力）、以及回收單克隆抗體序列。

芯片上抗體功能篩選的實驗設計

可溶性抗原的相對親和力排名能夠與使用Cell Analysis Suite（CAS®）軟件3.2+版本的所有物種Opto® B Discovery工作流程兼容。它還能用于雜交瘤或其他抗體分泌細胞系（如瞬時轉染細胞）的篩選。在芯片上完成單B細胞克隆后，使用多重熒光延時成像篩選抗體分泌細胞。檢測時需使用（i）包被有物種特異性IgG捕獲抗體的6-8µm檢測微珠；（ii）不同熒光基團標記的抗原和IgG二抗（圖2a）。通過使用IgG捕獲微珠，我們分別量化分泌的抗體量以及與抗原的結合量，進而評估結合強度（圖2b）。單B細胞分泌的抗體在NanoPen小室開口處及其周圍被微珠捕獲，分泌的抗體量與抗IgG二抗熒光強度等比例增強。抗原的熒光也因為抗體分泌量以及抗體結合親和力的差異顯示出不同的熒光強度（圖2c）。

圖2. 基于微珠的多重檢測用于快速獲得Beacon親和力評分。A) 相對親和力排名的捕獲測定試劑將抗IgG包被的珠子、熒光素標記的抗原和熒光素標記的二抗結合。B）檢測微珠和試劑被導入到OptoSelect® 芯片通道中。C) 使用多重熒光延遲成像來可視化在B細胞的NanoPen上方IgG分泌（綠色）和抗原特異性捕獲（品紅色）。

創新的抗體熒光定量方法用于親和力評分

Beacon®單細胞光導系統能夠自動識別數百至數千個結合抗體信號。完成初步分析后，CAS軟件利用機器學習算法識別分泌抗原特異性抗體的B細胞的NanoPen小室。除了識別陽性hits外，軟件現在還能夠自動計算IgG和抗原bloom的基于熒光的評分（圖3a）。該評分利用新開發的計算模型，根據熒光產生的時間、擴散的速度以及強度，得出IgG評分以量化捕獲的抗體量。相似的，抗原評分則將分泌抗體捕獲的抗原量進行量化（圖 3b，黃色文本）。然后在Assay Analyzer™中通過IgG評分對抗原評分均一化（抗原評分 ÷ IgG評分），得出Beacon親和力評分，為抗體與抗原的結合強度提供相對測量（圖3b，白色框）。

圖3. Beacon親和力評分通過IgG分泌將抗原結合進行均一化。A) IgG熒光強度與距離的擴散擬合曲線。從藍色到紅色的色梯表示時間進展。插圖為IgG分泌的顯微圖。B) 同一NanoPen上IgG（綠色）和抗原（品紅色）評分（黃色）以及對應的Beacon親和力評分（白色框）。

Beacon親和力評分的驗證

為了驗證親和力評分的效能，我們對六種分子量在18.6 kDa到125 kDa的可溶性抗原（TIM3、VEGFR2、IL6、IL10、IL17A和GMCSF）開展Opto® B Discovery抗體發現，抗原特異性抗體被隨機導出，這些抗體分的Beacon親和力評分隨機分布正在較廣范圍內（圖4，黑色輪廓點）。

圖4.對VEGFR2、TIM3、IL6、IL10、IL17A和GMSCF的抗體篩選進行Beacon親和力評分，并按每個實驗中的相對排名繪制。數據點從藍色（低親和力）到黃色（高親和力）著色。黑色輪廓點表示未排序導出的前48個hits，顯示出隨機分布在總評分范圍內。紫色框中的數據顯示了如果按Beacon親和力評分排序的前48個hits。百分比表示這些前48個hits與隨機選擇的hits的重疊比例。

我們針對每種抗原都選擇不同Beacon親和力評分的抗體進行重組表達，并使用生物膜干涉技術（BLI，Octet）對選擇的抗體進行親和力測定。實驗結果顯示Beacon親和力評分與實驗驗證的KD值具有相關性（圖5）。在不同的抗原中，我們發現親和力的范圍各不相同，有些范圍廣泛（例如，VEGFR2和TIM3，100 pM至100 nM），有些非常狹窄（例如，GMCSF，1 nM至15 nM）。我們通常可以區分親和力小于1 nM（圖5，黃色數據點）的抗體組與親和力大于10 nM（圖5，藍色數據點）的抗體組。

圖5.Beacon親和力評分與實驗驗證的KD值相關。Beacon親和力評分（y軸）與驗證的KD值（x軸，Log10 刻度）相關聯。虛線表示線性回歸擬合，Spearman相關系數（rho）和p值揭示了不同的相關性。

基于Beacon親和力評分對hits進行排序的能力對于具有廣泛抗體親和力范圍的抗原（如VEGFR2和TIM3）更為穩健；然而，當抗體的親和力范圍狹窄時（如針對GMCSF的抗體），排序的能力則相對有限。需要注意的是，Beacon親和力評分是單一抗原測定內的相對測量，并非對親和力的絕對定量。盡管存在這些局限性，Beacon親和力評分在不增強額外成本的情況下提供提前篩選抗體相對結合強度的機會。

使用高級可視化方法探索抗體庫

研究人員可以利用Beacon親和力評分來深入了解抗體庫，如應用UMAP等可視化手段，來分析獲得的抗體序列（圖6）[1]。通過將Beacon親和力評分與抗體氨基酸序列分析相結合，研究人員可以識別候選抗體的多樣性和高親和力抗體的聚類，探索編碼序列相似性與結合強度之間的關系，并選擇多樣化的候選抗體進行進一步表征。這種可視化和分析抗體庫的方法展示了Opto® B Discovery平臺生成的定量親和力數據如何與下游分析集成，以實現更有信息量和更高效率的抗體選擇。

圖6. VEGFR2特異性抗體序列的UMAP可視化。每個點代表一個單獨的抗體氨基酸序列，按Beacon親和力評分（藍色至黃色漸變）著色。星星表示BLI驗證親和力的抗體：黃色（KD <1 nM），灰色（KD 1-10 nM），藍色（KD >10 nM）。這種可視化使得探索序列多樣性、親和力聚類和選擇最佳抗體候選成為可能。

小結

布魯克細胞分析的Beacon®單細胞光導系統和Opto® B Discovery工作流程可以在單日內篩選多達數千個抗原特異性hits。創新的Beacon親和力評分算法提供對相對親和力的定量數據和排序，讓抗原抗體結合檢測實驗附加上更大價值。對分子量在18.6 kDa至125 kDa范圍內的幾種可溶性抗原的驗證數據顯示，其相對親和力排名與行業標準方法測量的解離常數具有很好的相關性。對抗體結合親和力的早期洞察將提升抗體篩選效率，增加抗體開發過程中下游成功的可能性。