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應用優勢 ■ 快速定量血漿和血清中的24種神經酰胺、 23種己糖基神經酰胺以及鞘氨醇 ■ 使用Quanpedia™和SOP構建性能穩定、便于部署的平臺，降低方法開發和培訓成本 ■ 使用TargetLynx™軟件和第三方信息學軟件（即Skyline）實現快速數據處理和數據可視化 ■ 比同類工作流程更快、更經濟

簡介鞘脂(SLs)是脂質中的一類，包括神經酰胺(Cer)、鞘磷脂(SM)和較為復雜的鞘糖脂。所有SLs都有一條“長鏈”，也就是鞘氨醇堿基鏈1 。這些堿基是鞘氨醇(SPH)等有機脂肪族氨基醇或者結構相似化合物（圖1）。這些化合物是細胞膜的重要組成部分，與多種生物功能有關，包括細胞信號轉導和細胞凋亡2,3。SLs在誘導腫瘤細胞增殖、研究化療耐藥機制方面起著關鍵的作用4 ，另外已有研究發現，帕金森患者體內的神經酰胺(Cer)和己糖基神經酰胺(HexCer)含量偏高5 。 SLs代謝轉化快、代謝物種類繁多且功能相似，給單獨研究某一種鞘脂的功能帶來了很大難度。

雖然質譜(MS)技術的進步讓研究人員得以進行更深入的脂質組學分析，但鑒定和定量分析依然比較困難。脂質有大量的同分異構和同量異位物質。此外，MS譜圖中通常有多種化合物的峰和碎片，要想對特定的分子進行明確鑒定和相對定量，不僅難度大，而且極為耗時。這嚴重阻礙了實驗室之間的脂質組學數據傳遞，導致研究人員難以通過多地點研究得出生物學解釋。本研究使用基于親水作用色譜(HILIC)的方法分離不同類別的脂質，然后使用MS進行檢測，從而降低了鑒定結果的不確定性6 。按照圖2. 大多數研究實驗室的通用脂質組學工作流程，圖中突出顯示了LipidQuan工作流程。類別分離不同的脂質還可以減少定量分析所需的穩定同位素標記(SIL)標準品，進而降低成本。本應用紀要介紹了在LipidQuan平臺（圖2）上運行基于HILIC的方法對Cer、HexCer、SPH進行的靶向篩查。

 

實驗：樣品向混合的健康人血漿中添加穩定同位素標記(SIL)的SLs（氘代CERAMIDE LIPIDOMIX™，Avanti Lipids，美國亞拉巴馬州阿拉巴斯特），制備九個不同濃度的標準品用于繪制定量用標準曲線。分析物的濃度范圍如下：C16神經酰胺-d7 (d18:1-d7/16:0) = 2.2-1090 ng/mL、C18神經酰胺-d7 (d18:1-d7/18:0)= 1.2-575 ng/mL、C24神經酰胺-d7 (d18:1-d7/24:0) =2.6-1315 ng/mL、C24:1神經酰胺-d7 (d18:1-d7/24:1) = 1.3-665 ng/mL。另外，通過萃取前加標的方式向NIST標準參比物質® 1950血漿中（Sigma Aldrich，英國普爾）添加5% SIL，制備6個重復樣。樣品制備樣品制備方案很簡單，使用預冷的異丙醇(IPA)沉淀蛋白（1:5，血漿:IPA）即可。將樣品渦旋混合1 min，在-20 °C下放置10 min。接著再將樣品渦旋混合1 min，然后在4 °C下放置2 h，確保蛋白沉淀*。將萃取的樣品在4 °C下離心10 min（大離心力10,300 g），然后將上清液轉移至玻璃樣品瓶，進行LC-MS/MS分析。

實驗 LC條件 LC系統： ACQUITY UPLC I-Class液相色譜系統固定定量環(FL)或流通針式(FTN) 色譜柱： ACQUITY UPLC BEH Amide 2.1 × 100 mm, 1.7 µm 柱溫： 45 °C 流速： 0.6 mL/min 流動相A： 95:5乙腈/水 +10 mM醋酸銨流動相B： 50:50乙腈/水 +10 mM醋酸銨梯度： 流動相B在2 min內從0.1%升至20.0%，然后在3 min內從20%升至80%，隨后重新平衡3 min 運行時間： 8 min 進樣體積： 1 µL MS條件 MS系統： Xevo TQ-S micro、Xevo TQ-XS和Xevo TQ-S 電離模式： ESI (+) 毛細管電壓： 2.8 kV (+) 采集模式： MRM 離子源溫度： 120 °C 脫溶劑氣溫度： 500 °C 錐孔氣流速： 150 L/h 脫溶劑氣流速： 1000 L/h 霧化氣： 7 bar 離子導入裝置偏移1： 3 V 離子導入裝置偏移2： 0.3 V

信息學軟件創建LipidQuan Quanpedia方法文件（1.4版），其中包含LC條件、MS方法以及相關的TargetLynx處理方法（包括保留時間和 MRM通道）。使用TargetLynx或Skyline（華盛頓大學MacCoss 實驗室軟件）處理所得數據。

結果與討論 LipidQuan使用正離子模式MRM對人血漿中的Cer和HexCer類物質進行定性和定量，同時還能分析其它脂類，如TG、PC、 SM。在HILIC分離條件下，Cer在溶劑前沿洗脫（大約0.4 min 處），HexCer和SPH類脂質洗脫為分離的峰（大約0.8-1.1 min 處），如圖3所示。總共分析了24種Cer、23種HexCer和SPH。得益于該方法的靈敏度，使用50 µL血漿可輕松檢測出人血漿中正常循環水平的這些脂質，其線性動態范圍覆蓋4個數量級。此處討論的Cer和HexCer脂質通道使用的是脂質母離子及其特征長鏈堿基(LCB)子離子(m/z 264)（圖1）。通道列表見表1和表2。使用萃取前加標已知濃度SIL標準品的血漿樣品制備標準曲線用于定量分析。采用相同條件制備和分析內源性脂質的替代標準品，對同類內源性脂質進行了定量分析。使用市售的預混合SIL 溶液而非每種待測脂質的SIL，可以顯著降低大規模研究的總體成本。SIL標準品C16神經酰胺-d7 (d18:1-d7/16:0)、C18神經酰胺-d7 (d18:1-d7/18:0)和C24神經酰胺-d7 (d18:1-d7/24:0)的標準曲線示例如圖4所示，可用于定量內源性的Cer和HexCer。使用氘代CERAMIDE LIPIDOMIX SIL標準品繪制標準曲線時，若典型R2 值＞ 0.95，且與擬合直線的偏差(CV) < 30%，則視為標準曲線可接受。C24:1神經酰胺-d7 (d18:1-d7/24:1)的標準曲線不符合此標準。由于事先已開發好LipidQuan Quanpedia方法文件，用戶只需下載用于分析Cer和HexCer脂質類別的MRM通道和色譜條件即可，無需手動輸入LC-MS方法，因此避免了可能出現的抄錄錯誤