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摘要：本應用簡報介紹了 AdvanceBio HIC 色譜柱的特性及其在抗體藥物偶聯物 (ADC) 分析中的應用。疏水相互作用色譜 (HIC) 是一種分離相互間疏水性逐漸增加的生物分子的方法。這種技術非常適合用于 ADC 的分析，因為這些復雜分子的疏水性通常高于未修飾的抗體。該技術可提供高分離度，能夠分離具有細微疏水性差異的物質，包括那些具有不同藥物/抗體比率 (DAR) 的 ADC。HIC 的優點之一在于洗脫所用的條件溫和，可確保生物分子保持在未變性狀態。這有利于對半胱氨酸連接的 ADC 的分析。

前言： HIC 使用含鹽流動相以減小生物分子溶解度，有利于這些分子吸附到 HIC 固定相上。通過梯度洗脫減小鹽濃度，能夠使分子按照疏水性逐漸增加的順序洗脫。分離過程類似于反相色譜，但是無需使用通常會導致蛋白質變性的離子對試劑和高濃度有機溶劑組分。這對分析通過半胱氨酸連接的 ADC 來說非常重要。用作有效載荷的小分子連接到部分還原的單克隆抗體 (mAb) 的自由巰基上，但這會導致多分散分布（圖 1）。測量這種分布（稱為 DAR）對于確定所獲得的 ADC 的效價至關重要。

實驗部分：儀器與材料所有化學品和試劑均為 HPLC 級或更高級別，且均購自 Sigma-Aldrich（現屬于 Merck）或 VWR Scientific。水經由 Milli-Q A10 水純化系統 (Millipore) 純化。儀器 Agilent 1260 Infinity II 生物惰性液相色譜儀包括： • Agilent 1260 Infinity II 生物惰性泵 (G5654A) • Agilent 1260 Infinity II 生物惰性 Multisampler (G5668A)，配備樣品冷卻裝置（選件編號 100） • Agilent 1260 Infinity II 高容量柱溫箱 (G7116A)，配備生物惰性熱交換器（選件編號 019） • Agilent 1260 Infinity II 二極管陣列檢測器 WR (G7115A)，配備生物惰性流通池（選件編號 028）

 

在樣品前處理過程中應小心操作，以確保樣品*溶解且不存在 DAR 異構體歧視；DAR 0 的親水性高于 DAR 8，并且能夠選擇性地溶解于流動相中。如果所有樣品未*溶解，則會導致誤差。在流動相條件中包括異丙醇梯度非常重要，否則 DAR 6 和 DAR 8 異構體將可能吸附到色譜柱上。圖 3A、3B 和 3C 表明，在異丙醇濃度不足的情況下，疏水性較強的 DAR 6 和 DAR 8 異構體被保留。

 

結果與討論 ：HIC 中使用的高濃度鹽意味著采用全生物惰性液相色譜是非常有利的。如果附帶密封墊清洗和進樣針清洗等避免鹽析問題的附加功能，那么將更加有利。然而，避免使液相色譜系統或色譜柱暴露于高濃度鹽溶液中仍然很重要。因此，采用四元液相色譜系統使其他通道能夠用于有機改性劑和水或其他沖洗溶劑。與 mAb 偶聯的疏水性藥物小分子的存在導致 mAb 分子的總體疏水性發生顯著改變。因此，需要在流動相中添加一些有機改性劑（參見方法條件和梯度曲線部分）。使用 HIC 能夠分析處于完整狀態的半胱氨酸連接的 ADC（圖 2）。如果采用反相技術，將會分離未通過半胱氨酸鍵連接的重鏈和輕鏈。反相色譜可用于分析半胱氨酸連接的 ADC，但是僅在這些分子*還原的情況下才能實現1 。

 

結論我們已經證明，通過控制流動相組成并選擇合適的流速和色譜柱尺寸，能夠使用 AdvanceBio HIC 色譜柱快速準確地分析 ADC 的 DAR 值。