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使用HILIC LC/MS 對哺乳動物細胞培養基進行監測
閱讀：1013 發布時間：2020-10-27摘要：將 Agilent InfinityLab Poroshell HILIC-Z 色譜柱與 Agilent 6545 Q-TOF LC/MS 結合使用，對六天內采集的哺乳動物細胞培養基中的養分吸收和分泌廢物進行監測。 HILIC-Z 色譜柱可保持良好的峰形與保留時間重現性，能適應高鹽樣品（如細胞培養基）。該方法通過優化流動相、梯度和儀器參數，可用于在負離子模式下的單次分析運行中對生長培養基的養分（即葡萄糖和氨基酸）與代謝廢物（即乳酸及 TCA 循環相關的其他有機酸）進行監測。
前言：質譜 (MS) 是一種高靈敏度分析技術，常用于針對各種小分子的代謝組學研究1 。哺乳動物細胞代謝組學一躍成為在多個研究領域中具備應用潛力的新興工具，研究細胞培養基中細胞消耗與分泌的多種代謝物變得越來越重要2,3。分析仍然面臨一些挑戰，包括陰離子代謝物的保留4 、樣品基質效應5 ，以及螯合有機酸和磷酸化合物的分析性能6 。為應對這些挑戰，開發了一種穩定且可重現的親水相互作用色譜 (HILIC) LC/MS 方法，方法中采用 InfinityLab 去活劑添加劑作為流動相改性劑，以增強金屬螯合有機酸和磷酸化分析物的峰形和檢測信號。作為色譜優化與 HILIC 色譜柱測試的一個步驟，對樣品基質中鹽濃度的影響進行了研究。研究中建立了一種分析細胞生長培養基中代謝物消耗和分泌的方法。
實驗部分：方法耐鹽性研究：為進行 HILIC LC/MS 方法開發，選擇了一套涵蓋磷酸化分析物與磷酸糖異構體的代謝物標準品。使用 Milli-Q 純化水配制 5 mg/mL 的分析物儲備液。然后用 80:20 的乙腈 (ACN)/水將儲備液稀釋為 1 ng/µL (ppm) 的樣品。在實驗中，配制一份高鹽儲備液（4 mol/L 尿素和 2 mol/L 氯化鈉 (NaCl) 水溶液）作為鹽加標樣。將高鹽溶液按 20% （80 mmol/L 尿素、40 mmol/L NaCl）與 40%（160 mmol/L 尿素、80 mmol/L NaCl）加標至代謝物標準品 (3 ng) 中。因為鹽不溶于樣品基質 (80% ACN)，因此沒有嘗試采用更高的鹽濃度 (> 40%)。細胞培養研究：在添加 10% 胎牛血清的 RPMI 1640 培養基中，培養 K562 白血病細胞。立即（第 0 天）、24 小時（第 1 天）、48 小時（第 2 天）、72 小時（第 3 天）或 6 天（第 6 天）后采集部分細胞和培養基。將樣品在 250 × g 條件下離心 5 分鐘，使細胞形成團塊。將生長培養基 (100 µL) 轉移至另一個離心管，與 400 µL 50% ACN 混合，再在 10000 × g 條件下離心 5 分鐘。然后，對 1 µL 上清液進行 HILIC LC/MS 分析。使用 Agilent MassHunter 定量分析軟件分析結果。
分析物分離：在 InfinityLab Poroshell 120 HILIC-Z, 2.1 mm × 50 mm, 2.7 µm, PEEK 內襯（部件號 679775-924）色譜柱上進行色譜分離。首先配制一份 10 倍流動相緩沖儲備液（100 mmol/L 乙酸銨， pH 9.0）水溶液，然后用水（A 溶液）或 ACN（B 溶液）配制 1 倍溶劑。在水溶液和有機流動相中添加 InfinityLab 去活劑添加劑（部件號 5191-4506），確保濃度在梯度洗脫過程中保持不變。儀器使用 Agilent 1290 Infinity 液相色譜儀與配備安捷倫噴射流離子源的 Agilent 6545 Q-TOF 的聯用系統進行 LC/MS 分析。液相色譜儀包括： • 帶清洗密封墊的 Agilent 1290 Infinity 二元泵 (G4220A) • 帶柱溫箱 (G1330B) 的 Agilent 1290 Infinity 自動進樣器 (G4226A) • 安捷倫柱溫箱 (G1316C) 通過連續注入參比質量溶液，實現動態質量軸校準。表 1 和表 2 匯總了優化的 LC 和 MS 條件。使用 Agilent MassHunter 軟件套件進行數據采集與分析。
結果與討論：利用 InfinityLab Poroshell HILIC-Z 色譜柱寬范圍的 pH 穩定性與高分離度，開發了一種簡單而穩定的 HILIC LC/MS 方法。在本研究中，pH 9.0 的流動相在色譜分離中獲得了整總體結果。此外，添加 InfinityLab 去活劑添加劑明顯改善了鰲合有機酸與磷酸化合物的峰形，同時增強了信號強度。在 DMEM 與 RPMI 1640 這兩種常用的培養基中，含有的高濃度無機鹽包括（NaCl，約 100 mmol/L）、（KCl，約 5 mmol/L）和硝酸鈣（Ca(NO3)2，約 0.4 mmol/L）。這些無機鹽可保持培養基滲透平衡，并有助于調節培養細胞的膜電位。為確定鹽對保留時間重現性與代謝物峰形的影響，我們使用 HILIC LC/MS 方法對濃度增加的尿素和 NaCl 加標樣品進行分析（圖 1）。結果表明，HILIC 色譜柱保持了保留時間重現性，同時高鹽樣品中的目標核苷酸（如 AMP、ADP、ATP 和 GTP）與磷酸糖異構體（如葡萄糖-1-磷酸鹽和葡萄糖-6-磷酸鹽）檢測到極小的離子抑制（圖 1）。
接下來，我們設計了一項實驗，用于監測細胞培養基在六天時間內的養分消耗與代謝物分泌（圖 2）。在生長培養基中，乳酸作為代謝廢物，隨時間推移而逐漸積累（圖 3，第 1 列）。此外，在監測過程中，有關 TCA 循環的其他有機酸（即蘋果酸、α-酮戊二酸 (α-KG)、谷氨酸和檸檬酸）在生長培養基中分泌并逐漸累積（圖 3）。相比之下，細胞在代謝過程中消耗了糖，因此葡萄糖濃度隨時間推移逐漸降低（圖 3，第 2 列），直至*耗盡（圖 3，第 2 列，第 6 天）。氨基酸濃度也隨時間推移而逐漸降低，這是因為細胞消耗了生長培養基中的養分（圖 4）。結果表明，在單次 HILIC LC/MS 運行中，可對哺乳動物細胞培養基中包括有機酸與氨基酸在內的各種代謝物進行分析和監測。