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檢測通過親水相互作用色譜對植物基質中的未衍生化氨基酸進行定量分析
閱讀：965 發布時間：2020-12-21摘要：本應用簡報介紹了一種使用三重四極桿液質聯用系統定量分析多種未衍生化氨基酸的方法。結果顯示，即使在存在大量植物基質（黃瓜莖葉組織萃取物）的情況下，靈敏度、線性與回收率均十分出色。使用親水相互作用色譜 (HILIC) 可分離強極性氨基酸。在 LC/MS 兼容條件下，充分利用新一代 Agilent InfinityLab Poroshell 120 HILIC-Z 固定相優異的分離度和峰形。
前言：多種氨基酸以百萬分之一 (ppm) 和十億分之一 (ppb) 級的水平廣泛存在于植物材料中。之前的研究中發現1 ，使用配備低 pH 與正離子模式質譜檢測的親水相互作用色譜 (HILIC) 模式分析未衍生化氨基酸，能夠獲得出色的分離度與靈敏度。本應用簡報對這些條件進一步優化，以對植物中的氨基酸進行定量分析。試劑與化學品所有試劑均為 HPLC 級或更高等級。超 LC/MS 級乙腈購自 J.T. Baker (Center Valley, PA, U.S.A.)。水的凈化處理由 EMD Millipore Milli-Q Integral 系統 (Darmstadt, Germany) 完成。試劑級甲酸（FA，部件號 G2453-85060）來自安捷倫科技公司。甲酸銨和氨基酸標樣購自 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)。氨基酸在使用前于 –70 °C 下儲存。 • Agilent InfinityLab 接頭 • 色譜柱前端：Agilent InfinityLab Quick Connect 快速連接液相色譜接頭（部件號 5067-5965） • 色譜柱末端：Agilent InfinityLab Quick Turn 液相色譜接頭（部件號 5067-5966） • 安捷倫樣品瓶，螺口蓋，棕色，帶書寫簽，經認證，2 mL （部件號 5182-0716） • 安捷倫固定螺口蓋，帶 PTFE/紅色硅膠隔墊（部件號 5190-7024） • Eppendorf 移液器和連續分液器 • 渦旋器和多管渦旋器 (VWR, Radnor, PA, USA) • Agilent InfinityLab 溶劑瓶，棕色，1000 mL（部件號 9301-6526） • Agilent InfinityLab Stay Safe 溶劑瓶安全蓋，GL45，3 個插口，1 個放空閥（部件號 5043-1219） • 離心機 (VWR, Radnor, PA, USA) • 超聲儀 (VWR, Radnor, PA, USA)
儀器 • Agilent 1260 Infinity 二元泵 (G1312B) • Agilent 1260 Infinity 自動進樣器 (G7129A) • Agilent 1260 Infinity 柱溫箱 (G1316A) • Agilent 1290 Infinity 液相色譜系列超低擴散工具包 (5067-5189) • Agilent MassHunter 工作站軟件 • Agilent 6470 三重四極桿液質聯用系統 • 安捷倫噴射流電噴霧離子源
樣品前處理：將氨基酸標準品與水混合至規定濃度，無需進一步樣品前處理即可直接分析。接下來，將 15N 富集的氘代內標 (ISTD) 加入到下列每個樣品中，至終濃度為 1500 ng/mL：異亮氨酸15N1、甲硫氨酸-d8、丙氨酸-d3、甘氨酸-d2、谷氨酸15N1、天冬氨酸-d3 和賴氨酸-d8。新鮮采集黃瓜葉片并立即置于液氮中快速冷凍，制備得到黃瓜莖葉組織萃取物。使用研缽和研杵將冷凍的黃瓜莖葉組織在液氮中均質研磨成細粉，然后儲存于 –85 °C 的冰箱中。
稱取 100 mg 冷凍的黃瓜葉片粉末到 2 mL Eppendorf 微量離心管中，加入 1 mL 0.5 M 鹽酸水溶液進行萃取。將離心管以 8000 rpm 的轉速渦旋混合 20 分鐘，在 25 °C 水浴中超聲 20 分鐘，然后在 20000 g 下離心 20 分鐘。后，將 250 µL 萃取上清液轉移到已加入 ISTD 的液相色譜樣品瓶中，然后用 80% 乙腈水溶液稀釋至 1 mL。
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結論：將 Agilent InfinityLab Poroshell 120 HILIC-Z 色譜柱的出色分離度和峰形性能與強大的 結論將 Agilent InfinityLab Poroshell 120 HILIC-Z 色譜柱的出色分離度和峰形性能與強大的 Agilent 6470 三重四極桿液質聯用系統結合，實現植物組織中未衍生化氨基酸的痕量分析。結果表明，該方法即使在基質中也具備可定量、可重現且穩定的優勢。系統結合，實現植物組織中未衍生化氨基酸的痕量分析。結果表明，該方法即使在基質中也具備可定量、可重現且穩定的優勢。