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PerkinElmer QSight 測定牛奶中多種抗生素藥物殘留量
閱讀：820 發布時間：2020-12-23簡介：抗生素曾被廣泛用于獸藥生產中，用于預防和治 療 疾 病 及 促 生 長 劑等。抗生素的濫用終導致牛奶、肉類等動物源性食品中抗生素殘留量嚴重超標，對人們健康帶來風險。抗生素的殘留會導致毒副反應，例如過敏反應、皮疹和惡心。另外，長期攝入抗生素殘留的食品，會導致抗藥性細菌的傳播。因此，世界各國都實施了動物抗生素使用法規。例如，歐盟和加拿大制定了食品中藥物高殘留量（MRL），美國將其稱為耐受水平。法規規定牛奶中抗生素殘留種類包括磺胺類、β內酰胺類、氟喹諾酮類、大環內酯和四環素。本文中牛奶里各類抗生素的*如表 1 所示。
本文建立了牛奶中抗生素多殘留的LC/MS/MS測定方法。抗生素種類包括環丙沙星、環丙沙星、氧氟沙星、青霉素 G、氯唑西林、替米考星、泰樂菌素、紅霉素、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲惡唑、磺胺二甲氧嘧啶、四環素和金霉素。以及兩種同位素內標為環丙沙星 -d8 和氟尼辛 -d3。采用改良的 QuEChERS 方法對牛奶中抗生素進行提取。本方法具有良好的線性，高靈敏度、回收率穩定、重現性高和特異性強的特點，滿足世界各國監管機構規定的牛奶中抗生素類殘留*的要求。
實驗方法：儀器設備 Perkinelmer Altus ™ UPLC® 液 相 系 統， 含 Altus A-30 溶 劑 管 理 模 塊、 樣 品 管 理 器 和 柱 溫 箱。 質 譜 儀： Perkinelmer QSight ™ 210 三重四極桿質譜儀。Simplicity 3Q ™軟件平臺控制所有儀器、采集和處理數據。方法參數液相色譜方法以及質譜離子源參數見表 2。溶劑、標準物及樣品前處理所用的溶劑、試劑和稀釋液純度均為 LC/MS 級。抗生素標準物購自 Sigma-Aldrich® 公司，并于 4℃冰箱中保存。除了 β- 內酰胺類使用水作為溶劑外，其余抗生素均使用甲醇配制溶液。β- 內酰胺類標準溶液需保存于塑料瓶中，其余抗生素類標準溶液可保存在塑料或玻璃瓶中。
從 C18 凈化劑購于 Supelco 公司。所有母液和工作標準溶液均冷藏保存，并使用 2mL 的棕色進樣小瓶，以防止化合物降解。同位素內標的使用：環丙沙星-d8用于氟喹諾酮，磺胺類和四環素類，氟尼辛-d3用于大環內酯和β-內酰胺類。
采用當地市場購得有機牛奶作為空白樣品，并對不同脂肪含量的 5 種牛奶樣品進行抗生素殘留檢測。采用簡單改良過 QuEChERS 前處理方法 2,3。具體步驟如下：（1）往 5mL 空白有機牛奶（已添加標準，濃度為 15ng/mL）中加入 20mL 有機溶劑（甲醇或乙腈）；（2）渦旋混勻 1min，置于 7800rpm 下離心 10min；（3）移取上清液，加入 1.2mg 的 C18 凈化劑 ，用于除去脂肪；（4）渦旋 5min，7800rpm 下離心 5 分鐘；（5）提取 12.5mL 上清液，于 40℃用氮氣吹至 1.5- 2mL；（6）用 15% 甲醇水溶液定容至 2.5mL，渦旋混勻；（7）過 0.22µm PVDF 微孔濾膜。本實驗采用基質匹配標準曲線進行定量分析，待上述步驟 7 完成后在進行基質配標及添加內標，基質標準曲線范圍在 0.1ng/ mL-1000ng/mL，每個濃度點重復進樣 5 次，進行精密度實驗。
質譜參數優化本實驗研究的目標化合物均采用正離子模式的電噴霧模式檢測。采用蠕動泵和液相色譜儀相結合，以三通連接的方式來優化質譜參數：如氣體流量、離子源溫度以及離子源的位置。蠕動泵以10µL/min的流速將0.5μg/mL磺胺甲嘧啶注入質譜，液相色譜儀以 0.5mL/min 的流速，溶液為乙腈水溶液（V/V， 10/90，含 0.1% 甲酸，5mM 甲酸銨）注入質譜中。每個化合物均采用濃度為 0.5μg/mL 來優化碰撞能量。Q1 和 Q3 的分辨率為 0.7amu。各個化合的質譜參數詳見表 3，每個化合物均采集 3 對 MRM 離子對，以降低假陽性或假陰性結果。
結果與討論：按照上述確定的實驗方法進行測試，各各個抗生素的校準曲線相關系數及 LOQ 見表 4。各個抗生素的 LOQ 比法規中耐受水平還要低至 5-100 倍。實驗結果表明，本方法*牛奶中抗生素的檢測要求。圖 1 為牛奶基質加標樣品（濃度為 5ng/mL）中磺胺甲嘧啶的提取離子色譜圖，從圖1可以看出，具有較高的信噪比。采用空白牛奶基質作為稀釋液，配制一系列濃度的標準曲線工作液（9 個濃度點），基質配標曲線范圍為 0.1-1000ng/mL。圖 2 為磺胺二甲嘧啶校準曲線示例，線性范圍大于 4 個數量級。所有抗生素化合物的校準曲線線性相關系數 R2 均大于 0.9958，具有良好的線性關系。表 5 為目標化合物在不同濃度下連續進樣的重現性數據。