亚洲AV成人片无码网站玉蒲团,男人10处有痣是富贵痣,AV亚洲欧洲日产国码无码苍井空,日韩午夜欧美精品一二三四区

應用優勢 ■ 教學式系統展示LC系統擴散對mAb的SEC 分離的影響 ■ 指導用戶根據所使用的LC系統和分析方法要求(包括分離度、靈敏度、重現性和可轉換性)選擇SEC色譜柱配置 ■ 展沃特世ACQUITY™ UPLC™ H-Class Bio和 ACQUITY Arc™ Bio系統的SEC分離性能

 

簡介過去，體積排阻色譜(SEC)是評估重組蛋白生物治療藥物中非共價蛋白質聚集體 (高分子量物質[HMWS])時應用廣泛的方法1 。但近年來，由于SEC色譜柱和LC 系統的性能提升，使用SEC對這些樣品中的蛋白質片段(低分子量物質[LMWS]) 在非變性的條件下進行分析的方法也越來越受到人們的關注。其中受關注的，是針對鉸鏈區水解降解所產生IgG單克隆抗體(mAb)片段的分析方法2 。相較于將單體(約150 KDa)與二聚體和更高分子量形式HMWS(≥300 KDa)分離的傳統分離方法，LMWS片段(分子量為mAb單體分子量三分之二(約100 KDa)的mAb主要形式)的分離可能更具挑戰性。這是由于LMWS與單體的大小 (流體動力學半徑)相比于單體與HMWS蛋白質的大小更加接近。由于蛋白質洗脫順序中低濃度LMWS峰作為主(單體)峰上的拖尾肩峰洗脫，使分離難度進一步增加。

 

雖然使用粒徑為亞2 µm的SEC色譜柱能夠提高效率，從而提高HMWS和LMWS 的分析通量，但由于色譜柱硬件和填料的限制，這些高柱效SEC顆粒僅適用于內徑為4.6 mm或更小的色譜柱。使用HPLC色譜系統時，通常因為SEC粒徑為3 µm 及以上，可以選擇7.8 mm內徑的色譜柱。雖然許多HPLC系統也能夠在這些內徑為4.6 mm的SEC色譜柱所需流速和背壓下運行，但存在一個經常被忽視的事實，即典型HPLC配置的柱外擴散相對大于這些UPLC SEC色譜柱所產生的峰體積，導致觀察到的峰分離度明顯降低3 。柱外擴散可以看作是樣品在通過不含色譜柱的LC系統流路時發生的體積增加現象。

 

本研究的目的是系統性評估SEC粒徑、色譜柱柱長和內徑以及LC系統柱外擴散對mAb的HMWS和LMWS的分離度的影響，文中所述基本原理適用于其它蛋白質的SEC分析。此外，還將演示系統擴散對LMWS的檢測下限和定量結果可靠性的不良影響。綜上，提供與 Waters™ LC儀器兼容的色譜柱的選擇建議。

測定系統擴散色譜分析的一條基本原理是：色譜柱以外發生的柱外擴散或柱外色譜峰/譜帶展寬始終會對分離度造成不良影響。在許多蛋白質和肽的梯度分離(例如反相和離子交換)中，分析物在上樣條件下與固定相強力結合，并在柱床的頭部重新濃縮，然后開始梯度洗脫。這些梯度分離方法，能夠大程度削弱甚至消除柱前譜帶擴散造成的不良影響，使分析人員的主要關注點轉向峰從色譜柱洗脫后發生的擴散。與此相反，在理想的SEC分離中，蛋白質樣品和SEC顆粒表面不發生結合。對于SEC分離的實際情況是，柱前擴散與柱后擴散一樣會降低分離質量。因此，評估樣品在通過不含色譜柱的LC系統后體積和曲線的變化可能十分有用。

 

柱外擴散(系統譜帶展寬)的測定已得到廣泛研究。感興趣的讀者可以參閱本應用紀要的姊妹篇《評估LC系統擴散對體積排阻色譜分析蛋白的影響》 (沃特世應用紀要，部件號：720006337ZH)，其中更全面地討論了系統擴散及其測定，并額外展示了有關柱外擴散對SEC分離影響的實驗。本文測定了5σec擴散體積(根據4.4%峰高處峰寬)，如圖1 所示。從圖2所示擴散曲線可見，柱外擴散峰不對稱(曲線存在明顯的拖尾或偏斜)，因此峰寬測定位置越接近基線，受峰拖尾的影響可能就越大。因此，選擇使用4.4%峰高處峰寬來測定5σ峰值雖然有些武斷，但這是大多數常用色譜數據系統(例如 Waters Empower 3和Agilent ChemStation)所提供的峰高百分比處的峰寬。通過在色譜柱入口側增加樣品定量環，ACQUITY UPLC H-Class Bio 系統上發生的各種柱外擴散情況如圖2所示