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日本乙型腦炎病毒（JEV）核酸檢測試劑盒(熒光-PCR法)

【產品名稱】

商品名稱：日本乙型腦炎病毒（JEV）核酸檢測試劑盒(熒光-PCR法)

Name  ：Japanese Encephalitis Virus Detection Kit (Real-Time PCR Method)

【包裝規格】50T/盒

【預期用途】

    日本乙型腦炎，又稱流行性乙型腦炎，簡稱乙腦，是由日本腦炎病毒（Japanese encephalitis，JEV）引起的一種人畜共患傳染病。JEV主要是通過帶病毒的蚊蟲叮咬傳播，而豬是JEV的主要增殖宿主和擴散宿主。JEV可引起妊娠母豬發生流產和死胎、公豬發生睪丸炎，新生仔豬發生腦炎、育肥豬持續高熱，對養殖戶造成巨大的經濟損失。日本乙型腦炎廣泛存在于世界許多國家，嚴重威脅著人類的健康。

本試劑盒適用于檢測的腦海馬回部組織、全血等標本中日本乙型腦炎病毒RNA，適用于日本乙型腦炎病毒感染的輔助診斷。其檢測結果僅供參考。

【檢驗原理】

本試劑盒用一對日本乙型腦炎病毒特異性引物，結合一條特異性熒光探針，用一步法熒光RT-PCR技術對日本乙型腦炎病毒RNA進行體外擴增檢測，用于臨床上對可疑感染者的病原學診斷。

【試劑組成】

注：

1）  不同批號試劑不能混用。

2）  試劑盒內各試劑組分足夠包裝規格所標示的檢測次數。

【儲存條件及有效期】

-20℃±5℃，避光保存、運輸、反復凍融次數不超過5次，有效期12個月。

【適用儀器】

ABI 、安捷倫MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf等系列熒光定量PCR檢測儀。

【標本采集】

病死或撲殺動物的腦海馬回部組織2g；待檢活動物，抽取全血5ml

【保存和運輸】

上述標本短期內可保存于-20℃，長期保存可置-70℃，但不能超過6個月，標本運送應采用2~8℃冰袋運輸，嚴禁反復凍融。

【使用方法】

1.樣品處理（樣本處理區）

1.1     樣本前處理

每份組織分別從3個不同的位置稱取樣品約1g，手術剪剪碎混勻后取0.5g于研磨器中研磨，加入1.5ml生理鹽水后繼續研磨，待勻漿后轉至1.5ml滅菌離心管中，8000rpm離心2min，取上清液100ul于1.5ml滅菌離心管中；全血樣品待血凝后取血清100ul于1.5ml滅菌離心管中。

1.2     RNA提取

推薦采用上海晅科生物科技有限公司生產的RNA提取試劑盒（離心柱提取法），請按照試劑盒說明書進行操作。

2.試劑配制（試劑準備區）

根據待檢測樣本總數，設所需要的PCR反應管管數為N(N=樣本數+1管陰性對照+1管陽性對照；樣品每滿7份，多配制1份)，每測試反應體系配制如下表：

將混合好的測試反應液分裝到PCR反應管中，21uL/管。

3.加樣（樣本處理區）

將步驟1提取的RNA、陽性質控品、陰性質控品各取4μL，分別加入相應的反應管中，蓋好管蓋，混勻，短暫離心。

4.PCR擴增（核酸擴增區）

4.1    將待檢測反應管置于熒光定量PCR儀反應槽內；

4.2    設置好通道、樣品信息，反應體系設置為25μL；熒光通道選擇：

檢測通道（Reporter Dye）FAM， 淬滅通道（Quencher Dye）NONE，ABI系列儀器請勿選擇ROX參比熒光，選擇None即可。

4.3    推薦循環參數設置：

5.結果分析判定

5.1    結果分析條件設定

設置Baseline和Threshold：一般直接按機器自動分析的結果分析，當曲線出現整體傾斜時，根據分析后圖像調節Baseline的start值(一般可在3~15范圍內調節)、stop值(一般可在5~20范圍內調節)，以及Threshold的Value值(上下拖動閾值線至高于陰性對照)，重新分析結果。

5.2結果判斷

陽性：檢測通道Ct值≤35，且曲線有明顯的指數增長曲線；

可疑：檢測通道35<Ct值≤38，建議重復檢測，如果檢測通道仍為35<Ct值≤38，且曲線有明顯的增長曲線，判定為陽性，否則為陰性；

陰性：樣本檢測結果Ct值>38或無Ct值。

6.質控標準

陰性質控品：Ct>38或無Ct值顯示；

陽性質控品：擴增曲線有明顯指數生長期，且Ct值≤32；

以上條件應同時滿足，否則實驗視為無效。

7.檢測方法的局限性

? 樣本檢測結果與樣本收集、處理、運送以及保存質量有關；

? 樣本提取過程中沒有控制好交叉污染，會出現假陽性結果；

? 陽性對照、擴增產物泄漏，會導致假陽性結果；

? 病原體在流行過程中基因突變、重組，會導致假陰性結果；

? 不同的提取方法存在提取效率差異，會導致假陰性結果；

? 試劑運輸，保存不當或試劑配制不準確引起的試劑檢測效能下降，出現假陰性或定量檢測不準確的結果；

? 本檢測結果僅供參考，如須確診請結合臨床癥狀以及其他檢測手段。

【注意事項】

? 所有操作嚴格按照說明書進行；

? 試劑盒內各種組分使用前應自然融化，wan全混勻并短暫離心；

? 反應液應避光保存；

? 反應中盡量避免氣泡存在，管蓋需蓋緊；

? 使用一次性吸頭、一次性手套和各區專用工作服；

? 樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區進行，以免交叉污染；

? 實驗完畢后用10%次氯酸或75%酒精或紫外燈處理工作臺和移液器；

? 試劑盒里所有物品應視為污染物對待，并按照《微生物生物醫學實驗室生物安全通則》進行處理。

【注意事項】

[1] 殷震，劉景 華.動物病毒學[M].第2版.北京：科學出版社，1997,631~640.

[1] 金寧，胡仲明，馮書章等.人畜共患病學[M].北京：科學出版社，2007,243~262.