研究背景

基于研究發(fā)現(xiàn)的肝臟 - 腦 - 腸神經(jīng)反射弧對維持腸道免疫穩(wěn)態(tài)起著關鍵作用，特別是其對腸道調(diào)節(jié)性 T 細胞（pTreg 細胞）生成和維持的影響，本研究方案旨在進一步深入探究該軸在腸道免疫調(diào)控中的具體機制。通過構建類器官模型并結合 Kirkstall Quasi Vivo 類器官串聯(lián)芯片動態(tài)灌流系統(tǒng)，模擬體內(nèi)復雜的生理環(huán)境，以更精準地揭示肝 - 腦 - 腸軸相互作用及其在腸道免疫中的功能。

研究目的

構建肝臟、腦干和腸道類器官，并成功將其整合至 Kirkstall Quasi Vivo 類器官串聯(lián)芯片動態(tài)灌流系統(tǒng)中，模擬體內(nèi)肝 - 腦 - 腸軸的生理結構和功能聯(lián)系。

研究肝臟 - 腦 - 腸神經(jīng)反射弧對腸道 APCs（抗原呈遞細胞）及 pTreg 細胞分化、增殖及功能的影響機制。 探索該軸在腸道炎癥發(fā)生發(fā)展過程中的作用，為開發(fā)針對腸道免疫相關疾病的新型治療策略提供理論依據(jù)和實驗支持。

一、 類器官構建與芯片整合

1. 類器官模塊選擇

1.1 肝臟模塊：

- 來源：人iPSC分化的肝類器官（含Kupffer細胞）

- 功能：感知腸道來源代謝物（如SCFAs、LPS），激活迷走神經(jīng)傳入

1.2 腸道模塊：

- 來源：結腸類器官（含CX3CR1?巨噬細胞/CD103? DCs）

- 功能：維持pTreg細胞生態(tài)位，表達ALDH/視黃酸

1.3 神經(jīng)模塊：

- 來源：人iPSC分化的迷走神經(jīng)節(jié)類器官 + 腸神經(jīng)元

- 功能：傳遞肝-腦干（NTS）-迷走傳出-腸神經(jīng)信號

2. 多器官芯片連接設計

Kirkstall Quasi Vivo 類器官串聯(lián)芯片動態(tài)灌流系統(tǒng)搭建：將構建好的肝臟、腦干和腸道類器官分別植入 Kirkstall Quasi Vivo 系統(tǒng)的相應芯片中，通過精確的管道連接和灌流設置，模擬體內(nèi)血液循環(huán)和組織間液流動，使三個類器官在動態(tài)的微環(huán)境中相互連接和作用。優(yōu)化灌流參數(shù)，如流速、流量等，確保類器官之間的物質(zhì)交換和信號傳遞接近體內(nèi)真實生理狀態(tài)。

二、 關鍵實驗干預

1. 神經(jīng)通路模擬

- 激活組：在肝臟模塊添加腸道代謝物（丁酸鹽/LPS），誘導迷走神經(jīng)激活

- 抑制組：

- 肝迷走神經(jīng)切斷（HVx模擬）：物理阻斷肝-神經(jīng)模塊連接

- 藥理學阻斷：添加毒蕈堿受體拮抗劑（如阿托品）

2. 免疫應答檢測

- 腸道模塊輸出：

- pTreg細胞比例（流式檢測：CD4?FoxP3?RORγt?）

- APC的ALDH活性（Aldefluor染色）

- 視黃酸合成量（HPLC-MS檢測）

三、 動態(tài)灌流參數(shù)

四、實驗檢測指標

4.1 細胞水平檢測

• 采用流式細胞術分析腸道類器官中 pTreg 細胞的比例、數(shù)量及其表面標志物的表達情況；同時檢測腸道 APCs（包括樹突狀細胞、巨噬細胞等）的亞群組成、活化狀態(tài)以及醛脫氫酶（ALDH）表達水平和視黃酸合成能力等指標，評估肝 - 腦 - 腸軸對腸道免疫細胞的調(diào)控作用。

• 利用免疫熒光染色和共聚焦顯微鏡觀察類器官間神經(jīng)元與免疫細胞的相互作用情況，如神經(jīng)纖維與腸道 APCs 的接觸部位、信號傳遞相關蛋白的表達等，從細胞層面揭示肝 - 腦 - 腸軸的免疫調(diào)節(jié)機制。

4.2 分子水平檢測

• 通過實時熒光定量 PCR（qPCR）檢測相關基因的表達變化，包括神經(jīng)系統(tǒng)相關基因（如神經(jīng)遞質(zhì)受體、離子通道等）、免疫相關細胞因子（如 TGF-β、IL-10、IL-17 等）以及 pTreg 細胞分化和功能相關基因（如 Foxp3、RORγt 等）。分析肝 - 腦 - 腸軸在不同實驗條件下對這些基因表達的調(diào)控作用，探討其潛在的分子機制。

• 運用 Western blot 技術檢測類器官中關鍵蛋白的表達水平和修飾狀態(tài)，如神經(jīng)遞質(zhì)受體蛋白、信號通路相關蛋白（如 pERK1/2 等）以及免疫相關蛋白（如免疫球蛋白、細胞粘附分子等）。通過蛋白表達的定量分析，進一步明確肝 - 腦 - 腸軸在細胞信號轉(zhuǎn)導和免疫調(diào)控中的作用途徑。

4.3 功能水平檢測

• 評估腸道類器官的屏障功能，如通過檢測腸道上皮細胞層的通透性（使用熒光標記的大分子物質(zhì)進行透性實驗）、緊密連接蛋白的表達等指標，了解肝 - 腦 - 腸軸對腸道屏障完整性的影響，以及在腸道炎癥發(fā)生過程中該軸如何調(diào)節(jié)腸道屏障功能以維持腸道內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。

• 進行體外免疫細胞功能實驗，如將腸道 APCs 與 T 細胞共培養(yǎng)，檢測 T 細胞的增殖、分化和細胞因子分泌情況，分析肝 - 腦 - 腸軸對 APCs 免疫功能的調(diào)節(jié)作用以及其對 T 細胞免疫應答的影響；同時開展 pTreg 細胞抑制功能實驗，評價肝 - 腦 - 腸軸調(diào)節(jié)的 pTreg 細胞在抑制腸道炎癥反應中的作用效果。

五、數(shù)據(jù)分析與統(tǒng)計方法

使用專業(yè)的數(shù)據(jù)分析軟件對實驗獲得的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。對于多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），若組間方差不齊則采用非參數(shù)檢驗方法；兩組間均數(shù)比較則使用獨立樣本 t 檢驗；相關性分析采用 Pearson 相關性檢驗或 Spearman 秩相關檢驗。以 P < 0.05 為差異有統(tǒng)計學意義的標準，所有數(shù)據(jù)以均數(shù) ± 標準誤（Mean ± SEM）表示。通過對實驗數(shù)據(jù)的系統(tǒng)分析，深入挖掘肝 - 腦 - 腸軸在腸道免疫調(diào)控中的作用機制和潛在規(guī)律。

六、預期結果

6.1 成功構建并整合肝臟、腦干和腸道類器官至 Kirkstall Quasi Vivo 類器官串聯(lián)芯片動態(tài)灌流系統(tǒng)，該系統(tǒng)能夠模擬體內(nèi)肝 - 腦 - 腸軸的生理結構和功能聯(lián)系，為研究三者之間的相互作用提供一個穩(wěn)定、可靠的體外模型。

6.2 在正常生理狀態(tài)下，肝 - 腦 - 腸軸通過神經(jīng)信號傳導維持腸道 APCs 的正常功能和 pTreg 細胞的穩(wěn)態(tài)水平；當神經(jīng)通路被阻斷時，腸道 APCs 的 ALDH 表達和視黃酸合成能力下降，pTreg 細胞數(shù)量減少，腸道免疫穩(wěn)態(tài)遭到破壞，表現(xiàn)出類似炎癥性腸病的免疫失衡特征。

6.3 在腸道炎癥模型中，肝 - 腦 - 腸軸的神經(jīng)反射活動增強，試圖通過調(diào)節(jié)腸道 APCs 和 pTreg 細胞來緩解腸道炎癥反應。而通過藥物干預調(diào)節(jié)該軸的功能（如激活或抑制特定神經(jīng)遞質(zhì)受體），可以有效改善腸道炎癥癥狀，增加 pTreg 細胞數(shù)量，增強其免疫抑制功能，從而為治療腸道炎癥性疾病提供新的潛在治療靶點和策略。

6.4 本研究將深化對肝 - 腦 - 腸軸在腸道免疫調(diào)控中作用機制的認識，為開發(fā)基于神經(jīng) - 免疫調(diào)節(jié)的新型治療策略提供關鍵實驗依據(jù)和理論支持。通過Kirkstall Quasi Vivo類器官串聯(lián)芯片動態(tài)灌流系統(tǒng)模擬體內(nèi)復雜的生理環(huán)境，不僅有助于更精確地研究細胞間的相互作用和信號傳遞，還為未來的個性化醫(yī)療和藥物研發(fā)提供了創(chuàng)新的研究平臺和工具。

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