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Kirkstall Quasi Vivo肝 - 腦 - 腸軸類器官神經(jīng)弧調(diào)控機制

時間:2025/5/30閱讀:238
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研究背景

基于研究發(fā)現(xiàn)的肝臟 - 腦 - 腸神經(jīng)反射弧對維持腸道免疫穩(wěn)態(tài)起著關鍵作用,特別是其對腸道調(diào)節(jié)性 T 細胞(pTreg 細胞)生成和維持的影響,本研究方案旨在進一步深入探究該軸在腸道免疫調(diào)控中的具體機制。通過構建類器官模型并結合 Kirkstall Quasi Vivo 類器官串聯(lián)芯片動態(tài)灌流系統(tǒng),模擬體內(nèi)復雜的生理環(huán)境,以更精準地揭示肝 - 腦 - 腸軸相互作用及其在腸道免疫中的功能。

研究目的

構建肝臟、腦干和腸道類器官,并成功將其整合至 Kirkstall Quasi Vivo 類器官串聯(lián)芯片動態(tài)灌流系統(tǒng)中,模擬體內(nèi)肝 - 腦 - 腸軸的生理結構和功能聯(lián)系。

研究肝臟 - 腦 - 腸神經(jīng)反射弧對腸道 APCs(抗原呈遞細胞)及 pTreg 細胞分化、增殖及功能的影響機制。 探索該軸在腸道炎癥發(fā)生發(fā)展過程中的作用,為開發(fā)針對腸道免疫相關疾病的新型治療策略提供理論依據(jù)和實驗支持。

一、 類器官構建與芯片整合

1. 類器官模塊選擇

1.1 肝臟模塊:

- 來源:人iPSC分化的肝類器官(含Kupffer細胞)

- 功能:感知腸道來源代謝物(如SCFAs、LPS),激活迷走神經(jīng)傳入

1.2 腸道模塊:

- 來源:結腸類器官(含CX3CR1?巨噬細胞/CD103? DCs)

- 功能:維持pTreg細胞生態(tài)位,表達ALDH/視黃酸

1.3 神經(jīng)模塊:

- 來源:人iPSC分化的迷走神經(jīng)節(jié)類器官 + 腸神經(jīng)元

- 功能:傳遞肝-腦干(NTS)-迷走傳出-腸神經(jīng)信號

2. 多器官芯片連接設計

Kirkstall Quasi Vivo 類器官串聯(lián)芯片動態(tài)灌流系統(tǒng)搭建:將構建好的肝臟、腦干和腸道類器官分別植入 Kirkstall Quasi Vivo 系統(tǒng)的相應芯片中,通過精確的管道連接和灌流設置,模擬體內(nèi)血液循環(huán)和組織間液流動,使三個類器官在動態(tài)的微環(huán)境中相互連接和作用。優(yōu)化灌流參數(shù),如流速、流量等,確保類器官之間的物質(zhì)交換和信號傳遞接近體內(nèi)真實生理狀態(tài)。

二、 關鍵實驗干預

1. 神經(jīng)通路模擬

- 激活組:在肝臟模塊添加腸道代謝物(丁酸鹽/LPS),誘導迷走神經(jīng)激活

- 抑制組:

- 肝迷走神經(jīng)切斷(HVx模擬):物理阻斷肝-神經(jīng)模塊連接

- 藥理學阻斷:添加毒蕈堿受體拮抗劑(如阿托品)

2. 免疫應答檢測

- 腸道模塊輸出:

- pTreg細胞比例(流式檢測:CD4?FoxP3?RORγt?)

- APC的ALDH活性(Aldefluor染色)

- 視黃酸合成量(HPLC-MS檢測)

三、 動態(tài)灌流參數(shù)

四、實驗檢測指標

4.1 細胞水平檢測

  • 采用流式細胞術分析腸道類器官中 pTreg 細胞的比例、數(shù)量及其表面標志物的表達情況;同時檢測腸道 APCs(包括樹突狀細胞、巨噬細胞等)的亞群組成、活化狀態(tài)以及醛脫氫酶(ALDH)表達水平和視黃酸合成能力等指標,評估肝 - 腦 - 腸軸對腸道免疫細胞的調(diào)控作用。

  • 利用免疫熒光染色和共聚焦顯微鏡觀察類器官間神經(jīng)元與免疫細胞的相互作用情況,如神經(jīng)纖維與腸道 APCs 的接觸部位、信號傳遞相關蛋白的表達等,從細胞層面揭示肝 - 腦 - 腸軸的免疫調(diào)節(jié)機制。

4.2 分子水平檢測

  • 通過實時熒光定量 PCR(qPCR)檢測相關基因的表達變化,包括神經(jīng)系統(tǒng)相關基因(如神經(jīng)遞質(zhì)受體、離子通道等)、免疫相關細胞因子(如 TGF-β、IL-10、IL-17 等)以及 pTreg 細胞分化和功能相關基因(如 Foxp3、RORγt 等)。分析肝 - 腦 - 腸軸在不同實驗條件下對這些基因表達的調(diào)控作用,探討其潛在的分子機制。

  • 運用 Western blot 技術檢測類器官中關鍵蛋白的表達水平和修飾狀態(tài),如神經(jīng)遞質(zhì)受體蛋白、信號通路相關蛋白(如 pERK1/2 等)以及免疫相關蛋白(如免疫球蛋白、細胞粘附分子等)。通過蛋白表達的定量分析,進一步明確肝 - 腦 - 腸軸在細胞信號轉(zhuǎn)導和免疫調(diào)控中的作用途徑。

4.3 功能水平檢測

  • 評估腸道類器官的屏障功能,如通過檢測腸道上皮細胞層的通透性(使用熒光標記的大分子物質(zhì)進行透性實驗)、緊密連接蛋白的表達等指標,了解肝 - 腦 - 腸軸對腸道屏障完整性的影響,以及在腸道炎癥發(fā)生過程中該軸如何調(diào)節(jié)腸道屏障功能以維持腸道內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。

  • 進行體外免疫細胞功能實驗,如將腸道 APCs 與 T 細胞共培養(yǎng),檢測 T 細胞的增殖、分化和細胞因子分泌情況,分析肝 - 腦 - 腸軸對 APCs 免疫功能的調(diào)節(jié)作用以及其對 T 細胞免疫應答的影響;同時開展 pTreg 細胞抑制功能實驗,評價肝 - 腦 - 腸軸調(diào)節(jié)的 pTreg 細胞在抑制腸道炎癥反應中的作用效果。

五、數(shù)據(jù)分析與統(tǒng)計方法

使用專業(yè)的數(shù)據(jù)分析軟件對實驗獲得的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。對于多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA),若組間方差不齊則采用非參數(shù)檢驗方法;兩組間均數(shù)比較則使用獨立樣本 t 檢驗;相關性分析采用 Pearson 相關性檢驗或 Spearman 秩相關檢驗。以 P < 0.05 為差異有統(tǒng)計學意義的標準,所有數(shù)據(jù)以均數(shù) ± 標準誤(Mean ± SEM)表示。通過對實驗數(shù)據(jù)的系統(tǒng)分析,深入挖掘肝 - 腦 - 腸軸在腸道免疫調(diào)控中的作用機制和潛在規(guī)律。

六、預期結果

6.1 成功構建并整合肝臟、腦干和腸道類器官至 Kirkstall Quasi Vivo 類器官串聯(lián)芯片動態(tài)灌流系統(tǒng),該系統(tǒng)能夠模擬體內(nèi)肝 - 腦 - 腸軸的生理結構和功能聯(lián)系,為研究三者之間的相互作用提供一個穩(wěn)定、可靠的體外模型。

6.2 在正常生理狀態(tài)下,肝 - 腦 - 腸軸通過神經(jīng)信號傳導維持腸道 APCs 的正常功能和 pTreg 細胞的穩(wěn)態(tài)水平;當神經(jīng)通路被阻斷時,腸道 APCs 的 ALDH 表達和視黃酸合成能力下降,pTreg 細胞數(shù)量減少,腸道免疫穩(wěn)態(tài)遭到破壞,表現(xiàn)出類似炎癥性腸病的免疫失衡特征。

6.3 在腸道炎癥模型中,肝 - 腦 - 腸軸的神經(jīng)反射活動增強,試圖通過調(diào)節(jié)腸道 APCs 和 pTreg 細胞來緩解腸道炎癥反應。而通過藥物干預調(diào)節(jié)該軸的功能(如激活或抑制特定神經(jīng)遞質(zhì)受體),可以有效改善腸道炎癥癥狀,增加 pTreg 細胞數(shù)量,增強其免疫抑制功能,從而為治療腸道炎癥性疾病提供新的潛在治療靶點和策略。

6.4 本研究將深化對肝 - 腦 - 腸軸在腸道免疫調(diào)控中作用機制的認識,為開發(fā)基于神經(jīng) - 免疫調(diào)節(jié)的新型治療策略提供關鍵實驗依據(jù)和理論支持。通過Kirkstall Quasi Vivo類器官串聯(lián)芯片動態(tài)灌流系統(tǒng)模擬體內(nèi)復雜的生理環(huán)境,不僅有助于更精確地研究細胞間的相互作用和信號傳遞,還為未來的個性化醫(yī)療和藥物研發(fā)提供了創(chuàng)新的研究平臺和工具。

北京基爾比生物科技公司主營產(chǎn)品:

Kilby 3D-clinostat 旋轉(zhuǎn)細胞培養(yǎng)儀,

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