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熒光定量pcr羅氏480使用步驟

2025-5-24  閱讀(151)

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羅氏LightCycler® 480 實時熒光定量PCR系統是實驗室中常用的一款中高通量qPCR平臺。以下是其標準的使用步驟流程,適用于絕大多數使用SYBR Green或TaqMan探針進行核酸擴增和定量分析的場景:


羅氏LightCycler® 480 使用步驟

一、實驗準備

  1. 核酸提取

    • 提取DNA或RNA(如為RNA需進行反轉錄獲得cDNA)

    • 評估濃度與純度(建議A260/A280介于1.8–2.0)

  2. 試劑準備

    • 根據實驗方案選擇合適的qPCR試劑(如SYBR Green I Master、Probe Master)

    • 準備引物/探針工作液,確保無氣泡、低溫避光保存


二、反應體系配置

標準反應體系(以20 µL體積為例):

成分體積(µL)
Master Mix10
Forward Primer (10 µM)0.4
Reverse Primer (10 µM)0.4
探針/染料(如適用)0.2
模板DNA/cDNA1–2
無RNAse水補足至20 µL

注意:

  • 所有反應成分應在冰上配置;

  • 引物濃度通常在0.2–0.5 µM之間;

  • 若使用多重qPCR,請確保熒光通道互不干擾。


三、裝板與封板

  1. 將反應混合液分裝至96孔或384孔反應板中;

  2. 使用專用光學封板膜密封反應板;

  3. 輕壓封膜并離心去除氣泡(例如2000 rpm × 30秒);

  4. 插入LightCycler® 480中指定托架位置。


四、程序設定(軟件操作)

在LightCycler® 480 Software中設置PCR程序,以下為常用的SYBR Green法設定模板:

  1. 預變性:95°C, 10 min

  2. 循環階段(40–45 cycles):

    • 變性:95°C, 10 sec

    • 退火:60°C, 20 sec(具體溫度依引物而定)

    • 延伸:72°C, 20 sec(有時與退火合并)

  3. 熔解曲線分析(如用SYBR Green)

    • 95°C, 5 sec

    • 65°C–95°C逐步升溫,每步0.5°C,采集熒光

  4. 熒光采集通道:根據染料選擇通道(如FAM通道用于SYBR或FAM-TaqMan探針)


五、運行與監控

  1. 確認熱蓋溫度(一般為105°C);

  2. 啟動程序運行,期間可實時觀察擴增曲線;

  3. 運行時間約為1.5–2小時(視程序設定而定);


六、數據分析

  1. 擴增曲線查看:確認每孔反應特征,是否存在拖尾、背景信號;

  2. Ct值判讀:導出或自動生成Ct結果表;

  3. 熔解曲線分析(SYBR Green):判斷特異性與是否出現非特異擴增;

  4. 標準曲線法(如絕對定量):生成曲線并計算拷貝數;

  5. 表達量分析(如相對定量):使用ΔΔCt法比較表達差異;


七、數據導出與保存

  • 可導出 .xls, .pdf, .xml 等格式結果;

  • 保存完整項目用于追溯和后續分析;

  • 建議同時備份至本地和實驗室服務器。


八、儀器清潔與維護

  • 每次使用后清理反應板托盤;

  • 定期進行光路校準與溫控驗證;

  • 每月檢查熱蓋壓力與熒光通道響應;

  • 若長期不使用,建議進行關機保護處理。


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