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TNF腫瘤壞死因子信號通路及功能作用介紹-賽默飛

TNF（腫瘤壞死因子）是什么？

細胞因子中的腫瘤壞死因子（TNF）超家族是一類多功能促炎細胞因子，可激活與細胞存活、凋亡、炎癥反應和細胞分化相關的信號通路。通過兩種受體 TNFR1（TNF 受體-1 或 CD120a）和 TNFR2（TNF 受體-2 或 CD120b）誘導對腫瘤壞死因子的細胞應答。TNFR1 在大多數人體組織中通過與 TNF α 結合而被激活。TNFR2 在免疫細胞中表達，并可被 TNFα 和 TNFβ 激活 [1]。Thermo Scientific™ 具有多種產品可幫助進行 TNF 研究。

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關鍵 TNF 通路靶點

TNF 與許多信號通路靶標相互作用，包括：

作為對炎癥和感染的應答，促炎細胞因子 TNFα 由巨噬細胞、淋巴細胞、成纖維細胞和角質形成細胞產生。TNFα 最初通過與細胞表面受體 TNFR1（p55）和 TNFR2（p75）結合而引發促炎信號。TNFR1 和 TNFR2 通過三種不同信號通路引發細胞對 TNFα的應答，導致 caspases 激活以及 AP-1 和 NFκB 轉錄因子的激活 [2]。激活 TNFα 導致 TNFR1 受體發生三聚化以及位于 TNFR1 蛋白胞質區的死亡結構域的結合。

死亡結構域的聚集引起 TRADD（TNFR 相關死亡結構域）銜接蛋白的募集。其他 TRADD 介導的 FADD（Fas 相關死亡結構域）、RAIDD（具有死亡結構域的 RIP 相關 ICH-1/CED-3 同源蛋白）、MADD（MAPK 激活死亡結構域）和 RIP（受體相互作用蛋白）的募集誘發激活 caspase 8。Caspase 8 介導一系列受調節的蛋白切割事件，最終導致細胞凋亡。

caspase 8 對 BID（BH3 相互作用死亡結構域）切割產生 tBID（截短型 BID），導致線粒體膜破壞和細胞色素 C（CytoC）的釋放。CytoC 與 APAF1（凋亡蛋白酶激活因子-1）結合使得 caspase 9 被募集，caspase 9 切割 caspase 3 產生其活性形式。XIAP（X-linked inhibitor of apoptosis，X 連鎖凋亡抑制蛋白）可抑制該信號通路中此階段 caspase 的激活。

TRAF2（TNF 受體相關因子-2）與 TRADD 的結合介導轉錄因子 AP-1 和 NFκB 通過 TNF 信號轉導的激活，從而與 MADD 和 RIP 形成激活的復合物。該復合物與 NIK（NF-κB-誘導激酶）結合后可磷酸化 IκK，此時，NFκB 易位至細胞核，引發 IκB 降解 [3]。TNFR1、TRADD、TRAF2、MADD、RIP 復合物（Jun NH2-末端激酶）可激活 MAPK，由此可激活 AP-1 轉錄復合物。AP-1 是許多應激和生長相關基因轉錄激活所必需 [4]。

TNF信號通路數據

Thermo Scientific™ 為 TNF 信號通路中的關鍵靶點提供抗體、ELISA、Luminex 多重檢測和生長因子。

以下是使用 Thermo Scientific™ 產品的 ELISA 和流式細胞分析數據。

用濃度為10 μg/mL 的抗牛 TNF-α 多克隆抗體（產品編號 PBOTNFAI）以100 µL/孔進行包被，并在 4℃ 下孵育過夜，進行 TNF-α 的 ELISA 分析。使用在 PBST 中稀釋的3%牛血清白蛋白（BSA）封閉孔板1小時。用200 µL/孔 PBST 洗滌孔板6次，然后在室溫下以100 µL/孔重組牛 TNF-α 蛋白標準品和組織培養上清液中的重組綿羊 TNF-α（均以未知濃度開始的按照 Log2 稀釋的稀釋液）孵育1小時。用洗滌緩沖液將孔板洗滌6次，并在室溫下用濃度為1 µg/mL 的抗牛 TNF-α 生物素偶聯多克隆抗體（產品編號 PBOTNFABI）以100 µL/孔孵育1小時。用洗滌緩沖液將孔板洗滌6次，然后使用2 µg/mL 的 HRP-偶聯鏈霉素親和素在室溫下擴增信號1小時。以100 µL/孔使用3,3',5,5'-四甲基聯苯胺（TMB）檢測10分鐘。用 0.2M 硫酸終止反應。在分光光度計上于450 nm 處讀取吸光度（光密度 [OD] 值）。

C57BL/6 脾細胞未進行刺激，或者在存在布雷非德菌素 A 的情況下，使用佛波醇肉豆蔻酸酯（PMA）和離子霉素對 C57BL/6 脾細胞刺激5小時。然后用抗小鼠 CD4 FITC（產品編號 MCD0401）對細胞進行表面染色，隨后使用 FIX & PERM 細胞透化試劑盒（產品編號 GAS003 或 GAS004）進行固定和透化，并用抗小鼠干擾素 γ（IFN-γ）PE-Cy7 偶聯物（產品編號 A18713）和抗小鼠腫瘤壞死因子（TNF-α）PPacific Blue™ 偶聯物（產品編號 RM90128）進行細胞內染色。使用 Attune 聲波聚焦流式細胞儀（藍色/紫色）采集樣品，采用488 nm 激發和530/30 nm 帶通發射濾光片檢測 FITC，采用640 nm 長通濾光片檢測 PE-Cy7 偶聯物。使用405 nm 激發和450/40 nm 帶通發射濾光片檢測 Pacific Blue™ 熒光。圖 A：在存在布雷非德菌素 A 的情況下，未進行刺激（左圖）或用 PMA 和離子霉素刺激（右圖）的總小鼠脾細胞的 IFN-γ 和 TNF-α 共染色。圖 B：用上述條件刺激后 CD4 T 細胞表達 TNF-α（左圖）和 IFN-γ（右圖）。

TNF信號通路有何功能？

TNF 信號傳導通路在各種生理和病理過程中發揮重要作用，包括細胞增殖、分化、細胞凋亡和免疫反應調節以及炎癥誘導。TNF (腫瘤壞死因子) 是一種多功能促炎細胞因子，可對脂質代謝、凝血、胰島素抵抗和內皮功能產生影響。自從 20 年前被發現以來，TNF 就一直被認為是一種抗癌劑。TNFR (TNF 受體) 超家族的成員可向細胞發出存活和死亡信號。

TNF 通過兩種受體 TNFR1 (TNF 受體-1) 和 TNFR2 (TNF 受體-2) 發揮作用。TNFR1 由所有人類組織表達，是 TNF α 的主要信號傳導受體。TNFR2 大多在免疫細胞中表達，并介導有限的生物反應。TNFR2 可結合 TNF α 和 TNF β (1,4)。

TNF α 通路

TNF α 是一種促炎細胞因子，由多種細胞類型產生，包括巨噬細胞、淋巴細胞、成纖維細胞和角質形成細胞，應對炎癥、感染和其他環境壓力。TNF α 可一系列不同的生物學效應，因細胞類型誘導而異。TNF α 通過在細胞表面與其受體 TNFR1 (p55) 和 TNFR2 (p75) 結合來起作用。大多數細胞都表達 TNFR1 ，后者被認為是 TNF α 細胞毒性的主要介體 (3 ， 5)。TNF α 與其兩種受體 TNFR1 和 TNFR2 結合，導致信號傳導子募集，至少活化三種不同的效應子。通過復雜的信號級聯和網絡，這些效應子會激活半胱天冬酶以及兩種轉錄因子：活化蛋白-1 和 NF-κB (核因子-KappaB)。最初，TRADD (TNFR 相關死亡結構域) 蛋白與 TNFR1 結合。然后， TRADD 募集 FADD (Fas 相關死亡結構域、RAIDD (RIP 相關 ICH-1/CED-3-同源蛋白伴有死亡結構域)、madd (MAPK 活化死亡結構域) 和 RIP (受體相互作用蛋白)。TRADD 和 FDD 與 TNFR1 結合可導致半胱天冬酶 8 的募集、低聚和激活。活化的半胱天冬酶 8 隨后啟動蛋白水解級聯，包括其他半胱天冬酶 (半胱天冬酶 3, 6 和 7)，并最終誘導細胞凋亡。半胱天冬酶 8 也裂解 BH3 (相互作用死亡結構域)。tBID (截短型) 可破壞外線粒體膜，導致促凋亡因子細胞 C (細胞色素-C) 的釋放。從膜間空間釋放的細胞因子 C 與 APAF1 (凋亡蛋白酶激活因子-1) 結合，后者可募集半胱天冬酶 9，而蛋白則可水解激活半胱天冬酶 3。新型 61-kDa 蛋白激酶 RIP2 與 RIP 有關，后者是 TNFR1 的組分，介導半胱天冬酶死亡蛋白酶的募集。RIP2 過表達同時發出 NF-KappaB 活化和細胞死亡的信號 (3, 5-9)。

利用 TNF RAF-2 活化信號傳導通路

TRAF2 (TNF 受體相關因子-2) 參與兩條不同的通路的激活，這些通路可通過 JNK (JUN NH2-末端激酶)、MEKK (MEK 激酶)、p38 以及 RIP 一起導致激活蛋白-1 的激活、， 還通過 NIK (NF- κ B 誘導激酶)激活 NF-κB 活化。已證明 TNF α 可激活 MAPK (促分裂原活化蛋白激酶)：ERK1 和 ERK2 (細胞外信號調節激酶)。過表達 SODD (死亡域沉默子) (一種與 TNFRI DD 相關的 60 kDa 蛋白)，可抑制 TNF 誘導細胞死亡和 NF-κB 活化，證明其作為這些信號傳導通路的陰性調節蛋白發揮作用。

TNF β 與 TNFR2 的相互作用

TNFR2 是 TNF β 的受體。TNF β 由活化的淋巴細胞產生，且可能對許多腫瘤和其他細胞具有細胞毒性。在中性粒細胞、內皮細胞和破骨細胞中，TNF β 可導致活化，而在許多其他細胞類型中，它還可導致 MHC 和粘附分子的表達增加。

TNF信號通路傳導的影響

TNF 信號通路與多發性硬化、阿爾茨海默病以及 TRAPS (TNF 受體相關定期綜合征)等相關。對 TNF 及其相關物的更好地了解，最終應該導致開發出小分子，后者可成功抑制和調節這些細胞因子的生物活性，從而為治療干預提供新的途徑。

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參考文獻

1. Kawasaki H. et al.(2002) Identification of genes that function in the TNFα-mediated apoptotic pathway using randomized hybrid ribozyme libraries.Nat Biotechnol 20: 376-80.

2. Kagoya, Y. et al.(2014) Positive feedback between NF-κB and TNF-α promotes leukemia-initiating cell capacity.J Clin Invest 124(2): 528-542.

3. Baud V. et al.(2001) Signal transduction by tumor necrosis factor and its relatives.Trends Cell Biol 11: 372-7.

4. Kai-Li He. et al.(2002) A20 Inhibits Tumor necrosis factor (TNF) α-Induced apoptosis by disrupting recruitment of TRADD and RIP to the TNF receptor 1 complex in jurkat T cells.Mol Cell Biol 22: 6034-6045.

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