1.樣品處理（樣本處理區）
1.1樣本前處理
取待檢樣品組織，加入 4 倍體積的 TE，勻漿化；將勻漿化的組織反復凍融 3 次，3000 r/min離心 30 min，取上清液。其他樣品前處理可參考 SNT4053-2014。
1.2核酸提取
推薦采用公司生產的核酸提取或純化試劑（磁珠法或離心柱法）進行核酸提取，請按照試劑說明書進行操作。
2.試劑配制（試劑準備區）
根據待檢測樣本總數，設所需要的 PCR 反應管管數為 N(N=樣本數+1 管陰性對照+1 管陽性對照；樣品每滿10 份，多配制 1 份)，每測試反應體系配制如下表：
試劑 反應液酶液
用量（樣本數為 N）19μL1μL
將混合好的測試反應液分裝到 PCR 反應管中，20μL /管。
3.加樣（樣本處理區）
將步驟 1 提取的核酸、陽性質控品、陰性質控品各取 5μL，分別加入相應的反應管中，蓋好管蓋，混勻， 短暫離心。
4.PCR 擴增（核酸擴增區）
4.1將待檢測反應管置于熒光定量 PCR 儀反應槽內；
4.2設置好通道、樣品信息，反應體系設置為 25μL；熒光通道選擇： 檢測通道（Reporter Dye）FAM， 淬滅通道（Quencher Dye）NONE，請勿選擇ROX 參比熒光，選擇 None 即可。
4.3推薦循環參數設置：
步驟循環數溫度時間收集熒光信號
11 cycle95℃2min否
245 cycles95℃15sec否
60℃30sec是
5.結果分析判定
5.1結果分析條件設定（請參照各儀器使用說明書進行設置，以分析 ABI7500 儀器為例）
反應結束后自動保存結果，根據分析后圖像調節 Baseline 的 Start 值、End 值以及 Threshold 值（用戶可根據實際情況自行調整，Start 值可以在 3～15、End 值可設在 5～20，使閾值線位于擴增曲線指數器，陰性質控品的擴增曲線平直或低于閾值線），點擊 Analyze 自動獲得分析結果。
5.2結果判斷
陽性：檢測通道 Ct 值≤40，且曲線有明顯的指數增長曲線； 陰性：樣本檢測結果 Ct 值>40 或無 Ct 值。
5.3質控標準
陰性質控品：無特異性擴增曲線或無 Ct 值顯示；
陽性質控品：擴增曲線有明顯指數增長期，且Ct 值≤32； 以上條件應同時滿足，否則實驗視為無效。
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