Endothelial-mesenchymal crosstalk drives osteogenic differentiation of human osteoblasts through Notch signaling

Keywords: Co-culture; Endothelial cells; Notch signaling; Osteoblasts; Osteogenic differentiation.

骨形成與血管生成密切相關(guān)。內(nèi)皮細(xì)胞（EC）和骨形成細(xì)胞，如成骨細(xì)胞（OB）之間的相互作用對正常骨發(fā)育和修復(fù)至關(guān)重要。通常認(rèn)為，EC 與骨組織細(xì)胞之間相互作用的主要機(jī)制與旁分泌信號有關(guān)。在骨組織中，ЕС 促進(jìn)特定信號通路的激活，通過旁分泌機(jī)制刺激成骨細(xì)胞分化。相反，內(nèi)皮通常會阻止血管系統(tǒng)中的鈣化，與 EC 功能相關(guān)的疾病會導(dǎo)致微環(huán)境的異常變化、內(nèi)皮一氧化氮（NO）分泌減少和成骨因子分泌增加，從而導(dǎo)致異常成骨分化和異位鈣化。

然而，似乎不僅旁分泌因子對鈣化過程有顯著影響，考慮旁分泌信號在 EC 與可發(fā)生成骨分化的細(xì)胞之間相互作用中的影響也很重要。鄰分泌（Juxtacrine）信號傳導(dǎo)揭示了可通過位于細(xì)胞表面的各種蛋白質(zhì)分子進(jìn)行細(xì)胞間相互作用。在血管成骨的背景下，它可以通過以下方式實現(xiàn)：通過細(xì)胞粘附分子—整合素和鈣粘蛋白與細(xì)胞外基質(zhì)蛋白（ECM）結(jié)合；通過間隙連接—連接蛋白和配體-受體相互作用，即通過 Notch 信號通路。

揭示內(nèi)皮細(xì)胞和成骨細(xì)胞相互作用的復(fù)雜機(jī)制對于理解骨內(nèi)穩(wěn)態(tài)和心血管組織異常礦化過程之間的平衡至關(guān)重要。最近，俄羅斯圣彼得堡 RAS 細(xì)胞學(xué)研究所及Vreden國家創(chuàng)傷學(xué)和骨科醫(yī)學(xué)研究中心團(tuán)隊探索了體外成骨細(xì)胞分化的背景下介導(dǎo) EC 和 OB 之間串?dāng)_的旁分泌和鄰分泌機(jī)制，研究證明，在成骨分化誘導(dǎo)過程中，人成骨細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞之間是否存在直接接觸可能影響骨誘導(dǎo)或骨抑制作用。這一新發(fā)現(xiàn)奠定了 Notch 信號以及成骨細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞之間的物理相互作用在成骨分化中的關(guān)鍵作用，并為基于 Notch 信號的成骨分化相關(guān)病理的治療提供了潛在基礎(chǔ)。研究成果發(fā)表于Cell Communication and Signaling期刊題為“Endothelial-mesenchymal crosstalk drives osteogenic differentiation of human osteoblasts through Notch signaling”。

首先，為了研究 EC 和 OB 之間的細(xì)胞間相互作用對成骨分化的影響，使用直接和間接共培養(yǎng)模型（圖1 A）。結(jié)果表明，與 OB 單一培養(yǎng)相比，間接共培養(yǎng)抑制了成骨分化，而直接接觸增加了基質(zhì)鈣化（圖1 B-C）。使用 RT-PCR  在早期階段觀察到，不同的共培養(yǎng)條件下 OB 中相似的成骨標(biāo)志物表達(dá)，除了 COL1A1 在 OB 直接共培養(yǎng)時有差異（圖1 D）。因此，實驗發(fā)現(xiàn)，根據(jù)細(xì)胞之間是否存在直接接觸，EC 可以對 OB 成骨分化同時具有骨誘導(dǎo)和骨抑制作用。

圖1     EC 和 OB 的共培養(yǎng)條件會影響成骨分化。

進(jìn)一步分析 OB 和 EC 在不同共培養(yǎng)條件下的蛋白質(zhì)組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)譜（圖2 A）。在 OB 的生物信息學(xué)分析過程中，鑒定了 22351 個轉(zhuǎn)錄本和 2966 個蛋白質(zhì)；EC鑒定了 22539 個轉(zhuǎn)錄本和 3073 個蛋白質(zhì)（圖2 B、C）。主成分分析（PCA）表明，根據(jù)轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)，OB 在直接、間接和對照條件下形成混合簇（圖2 D）。這表明，當(dāng) OB 和 EC 共培養(yǎng)時，OB 譜保持相當(dāng)穩(wěn)定。與成骨細(xì)胞不同，EC 在與 OB 共培養(yǎng)的不同條件下表現(xiàn)出不同的蛋白質(zhì)組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)特征（圖2 E），表明 EC 對與 OB 共培養(yǎng)的各種條件有顯著的反應(yīng)。

差異表達(dá)分析顯示，當(dāng) OB 直接共培養(yǎng)時，成骨標(biāo)志物和 Notch 信號通路成分的表達(dá)增加。基因本體論（GO）分析突出了與細(xì)胞外基質(zhì)重組和細(xì)胞運動相關(guān)的激活過程，而激酶活性、MAPK 信號和細(xì)胞增殖等過程受到抑制。通路分析確定了細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體和 Notch 信號通路的激活，以及 Rap1 和 Wnt 信號的抑制。當(dāng) OB 間接共培養(yǎng)時，發(fā)現(xiàn)與細(xì)胞周期、p53 和 FoxO 通路相關(guān)的轉(zhuǎn)錄本下調(diào)。

當(dāng) EC 間接共培養(yǎng)時，在上調(diào)元件中，BMP 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑、SMAD 蛋白、TGF-β 配體和 IHNBA 最為突出。Jak/STAT 通路成分在蛋白質(zhì)組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)中也顯著上調(diào)。此外，對內(nèi)皮功能很重要的關(guān)鍵因子，包括一氧化氮合酶1（NOS1）、NOS3 和 KLF4 表達(dá)均有所增加。進(jìn)一步分析確定了 TGF-β 和細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用通路的參與，而下調(diào)的轉(zhuǎn)錄本與細(xì)胞粘附和 Ras/PI3K-Akt 信號有關(guān)，這在蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)中也觀察到。

當(dāng) EC直接共培養(yǎng)時，同樣觀察到參與 BMP 信號和 Jak/STAT 信號的的成分表達(dá)增加。與 EC 間接共培養(yǎng)不同的是，在 EC 直接共培養(yǎng)中觀察到 PI3K-Akt 信號通路轉(zhuǎn)錄本的上調(diào)。然而，直接共培養(yǎng)過程中較顯著的轉(zhuǎn)錄組變化與骨骼發(fā)育過程有關(guān)，涉及 RUNX2、ALPL、LOX、WNT5A、WNT5B 和骨組織膠原蛋白等關(guān)鍵樞紐基因。在這些信號通路中，Notch 通路成為主要參與者。已知該通路可促進(jìn)內(nèi)皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，與在直接共培養(yǎng)中觀察到的 SNAI2、TWIST1 和 ACTA2 激活一致。實驗已經(jīng)確定，只有直接共培養(yǎng)會導(dǎo)致 Notch 信號成分的表達(dá)水平增加，當(dāng)使用間接培養(yǎng)方法培養(yǎng) OB 和 EC 時，在 Notch 受體和配體的表達(dá)中沒有觀察到這種增加。

這些數(shù)據(jù)表明，OB 在與 EC 的不同共培養(yǎng)條件下表現(xiàn)出相似的蛋白質(zhì)組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)特征，而 EC 表現(xiàn)出不同的分子特征，表明它們對不同的共培養(yǎng)條件有顯著的反應(yīng)。與 OB 的間接共培養(yǎng)刺激了 EC 中 BMP 信號通路的多種抑制劑的產(chǎn)生，這是已知成骨分化的關(guān)鍵驅(qū)動因素。同時，EC 和 OB 之間的直接細(xì)胞間接觸可激活 Notch 信號通路。這種 Notch 介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)反過來又誘導(dǎo)了 EC 群體中與成骨分化相關(guān)的基因的表達(dá)。

圖2    OB 和 EC 在不同共培養(yǎng)條件下的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析。

接下來，為了找出 EC 中 Notch 信號通路各種成分活性的降低如何影響直接共培養(yǎng)中 OB 的成骨分化，在共培養(yǎng)前用一種攜帶靶向 Notch 通路基因的 shRNA 慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo) EC（圖3 A、B）。根據(jù)染色結(jié)果，發(fā)現(xiàn) EC 中 Notch 信號通路的某些組分（NOTCH1、NOTCH3、NOTCH4 和 MAML1）的敲低在共培養(yǎng)時對 OB 的成骨轉(zhuǎn)化具有抑制作用。此外，NOTCH1 和 NOTCH3 的敲低顯示出較強(qiáng)的影響。下一步繼續(xù)研究了 EC 中 Notch1 或 Notch3 的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域?qū)?Notch 的激活如何影響直接共培養(yǎng)過程中 OB 的成骨分化（圖3 C）。OB 與過表達(dá) Notch1（NICD1）和 Notch3（NICD3）細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的 EC 共培養(yǎng)導(dǎo)致鈣化水平增加。茜素紅染色強(qiáng)度的定量分析證實，相對于對照共培養(yǎng)，OB 的成骨分化程度在統(tǒng)計學(xué)上顯著增加或減少（圖3 D）。這說明，OB 的成骨分化可以在細(xì)胞間直接接觸期間通過調(diào)節(jié) EC 中的 Notch 信號來控制。

圖3    誘導(dǎo)成骨分化 14 天后，完整原代 OB 和轉(zhuǎn)導(dǎo)的 EC 直接共培養(yǎng)的茜素紅染色。

最后，為了闡明由 Notch 信號通路的失活/激活導(dǎo)致的 EC 的哪些變化會影響 OB 的成骨分化，實驗鑒定了用慢病毒構(gòu)建體（激活 NICD1 和 NICD3 或抑制 NOTCH1 和 NOTCH3）修飾的 EC 的轉(zhuǎn)錄組譜（圖4 A）。差異表達(dá)基因（DEG）分析表明，與失活的 Notch 樣本相比，Notch 結(jié)構(gòu)域激活的樣本中檢測到的 DEG 分別高出 1.5-1.7 倍。這一趨勢表明，Notch 胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的激活比敲低 Notch 受體對整體基因表達(dá)譜變化的貢獻(xiàn)更大。由 shNOTCH1 或 shNOTCH3 轉(zhuǎn)導(dǎo)的 EC 形成混合簇，而過表達(dá) NICD1 和 NICD3 的 EC 在 PCA 上也彼此靠近聚集，但沒有重疊（圖4 B）。

在每組中顯示特定改變的前幾個差異表達(dá)基因（圖4 C）。過表達(dá) NICD1 和 NICD3 的 EC 顯示 ANGPTL2、PLVAP、LAMB3、SLCA4、MEST、SEMA5A、GUCY1A1、SLC46A3、SFRP1、SULF1、OFLML2A、ITGA11、LINC01614、COL8A 和 SDC2 的表達(dá)增加。對于敲低 NOTCH1 和 NOTCH3 的 EC，DYSF、MMP10、PTGS1、SGK1、APLN、ANXA3、PLAT、MT2A、EDN1 和 CD247 基因的表達(dá)增加。還發(fā)現(xiàn) EC 中 NICD1 和 NICD3 的過表達(dá)以及 NOTCH1 和 NOTCH3 的敲低均顯著降低 ENSG00000284946、SPAG5、HMGB2、PLK1 和 PRC1 的表達(dá)。

此外，實驗選擇了一組在兩個方向上都顯示出對 Notch 信號調(diào)節(jié)的反應(yīng)性轉(zhuǎn)錄譜的基因，確定在 NICD1 和 NICD3 激活的 EC 中，轉(zhuǎn)錄本 GJA5、SULF1、SDC1、DLL4、TMTC1、CRYAB、PTHLH 和 PCDH7 上調(diào)。相反，在 NOTCH1 和 NOTCH3 敲低的 EC 中，這些相同轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)降低（圖4 D）。

對 DEGs 進(jìn)行功能注釋，結(jié)果表明，NICD1 和 NICD3 過表達(dá)導(dǎo)致 EC 中表達(dá)水平升高的 DEGs 與細(xì)胞外結(jié)構(gòu)、細(xì)胞外基質(zhì)組織以及骨化相關(guān)的基因表達(dá)有關(guān)。同時，通過分析鑒定的代謝通路與 TGF-β 信號和 PI3K-AKT 信號通路有關(guān)。對于 EC 中 NOTCH1 和 NOTCH3 的敲低，觀察到與染色體分離、DNA 復(fù)制和細(xì)胞周期相關(guān)的過程下調(diào)。

圖4    Notch 激活/失活期間 EC 的轉(zhuǎn)錄組學(xué)特征。

圖5    圖形概要

總之，該研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞對成骨分化過程具有雙重影響。抑制成骨特性與內(nèi)皮細(xì)胞分泌的旁分泌因子的作用有關(guān)。而內(nèi)皮細(xì)胞的誘導(dǎo)成骨特性是由 Notch 信號通路介導(dǎo)的，并且只有在與間充質(zhì)細(xì)胞（這里指成骨細(xì)胞）物理接觸的情況下才能實現(xiàn)。研究確定了內(nèi)皮細(xì)胞中 Notch1 和 Notch3 的失活抑制了成骨細(xì)胞的成骨分化，而激活內(nèi)皮細(xì)胞中 Notch1 和 Notch3 提高了內(nèi)皮-成骨細(xì)胞共培養(yǎng)物的成骨分化程度。因此，內(nèi)皮細(xì)胞 Notch 通路的修飾可能是增強(qiáng)/抑制成骨細(xì)胞成骨分化的工具。

參考文獻(xiàn)：Perepletchikova D, Kuchur P, Basovich L, Khvorova I, Lobov A, Azarkina K, Aksenov N, Bozhkova S, Karelkin V, Malashicheva A. Endothelial-mesenchymal crosstalk drives osteogenic differentiation of human osteoblasts through Notch signaling. Cell Commun Signal. 2025 Feb 19;23(1):100. doi: 10.1186/s12964-025-02096-0. Erratum in: Cell Commun Signal. 2025 Mar 12;23(1):133. doi: 10.1186/s12964-025-02118-x. PMID: 39972367; PMCID: PMC11841332.

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