一、背景

大鼠垂體瘤細胞是由Tashjian AH等在1965年7月從一只7月齡的雌性Wistar-Furth大鼠的垂體腫瘤中分離建立的。GH3細胞系不是直接來源于GH1細胞系的克隆，而是從原代培養(yǎng)的GH1細胞在大鼠身上傳代兩次形成的腫瘤中建立的。上皮樣的GH3細胞比GH1分泌更高水平的生長激素，也可產(chǎn)生催乳素。對調(diào)控GH3細胞分泌蛋白類激素的研究表明，氫化可的松可以刺激生長激素的分泌、抑制催乳素的產(chǎn)生。

二、大鼠垂體瘤細胞培養(yǎng)步驟

1、大鼠垂體瘤細胞培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準(zhǔn)備：

1）準(zhǔn)備RPMI-1640培養(yǎng)基(RPMI-1640:GIBCO,貨號31800022,添加NaHCO3 1.5g/L,D-葡萄糖2.5g/L,丙酮酸鈉0.11g/L)，90%；優(yōu)質(zhì)胎牛血清，10%。

2）大鼠垂體瘤細胞培養(yǎng)條件：氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。溫度：37攝氏度，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。

3）大鼠垂體瘤細胞凍存液：90%培養(yǎng)基，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。液氮儲存。

2、大鼠垂體瘤細胞細胞處理：

1）復(fù)蘇大鼠垂體瘤細胞：將含有1mL細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入4mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓毎麘乙杭尤?0cm皿中，加入約8ml培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并檢查細胞密度。

2）大鼠垂體瘤細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng)。

對于懸浮細胞，傳代可參考以下方法：

方法一：收集細胞，1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻，將細胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。

方法二：可選擇半數(shù)換液方式，棄去半數(shù)培養(yǎng)基后，將剩余細胞懸起，將細胞懸液按1：2到1：3的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。

3）大鼠垂體瘤細胞凍存：待細胞生長狀態(tài)良好時，可進行細胞凍存。懸浮細胞凍存時，應(yīng)將細胞收集，1000RPM條件下離心4分鐘，少量保存上清液（防止細胞吸走），加入部分新鮮培養(yǎng)基，加入到凍存管中，在凍存管中加入10%DMSO后進行凍存。

三、應(yīng)用

大鼠垂體瘤細胞可以用于LncRNA MEG3對垂體瘤細胞增殖，凋亡及EMT影響及其分子機制：

探討lncRNA MEG3在垂體瘤中的作用及其機制。

部分LncRNA MEG3在垂體瘤組織中的表達目的:檢測lncRNA MEG3在垂體瘤患者中的表達。

方法：

1、GSE77517從GEO數(shù)據(jù)庫下載。

2、搜集垂體瘤患者腫瘤組織樣本和正常癌旁組織樣本34對,qRT-PCR檢測lncRNA MEG3表達。

3、qRT-PCR檢測不同分期垂體瘤腫瘤組織中MEG3的表達。

4、Pearson’sχ2分析MEG3的表達與垂體瘤患者臨床特征的關(guān)系。

結(jié)果：

1、相較于正常組織,lncRNA MEG3在垂體瘤腫瘤組織中表達量顯著降低。

2、LncRNA MEG3在Ⅲ-Ⅳ期垂體瘤患者組織中的表達顯著低于Ⅰ-Ⅱ期垂體瘤患者。

3、LncRNA MEG3的表達與垂體瘤的侵襲性和臨床等級顯著相關(guān)。

結(jié)論：LncRNA MEG3在垂體瘤患者組織中低表達并與垂體瘤的侵襲性和臨床等級顯著相關(guān)。

第二部分LncRNA MEG3對大鼠垂體瘤細胞活性的影響目的:探討LncRNA MEG3對大鼠垂體瘤細胞活性。

方法：

1、設(shè)計MEG3過表達序列,在大鼠PA細胞MMQ和GH3中上調(diào)MEG3的表達。

2、細胞增殖通過CCK-8法檢測。

3、流式細胞儀和蛋白質(zhì)印跡法檢測PA細胞凋亡。

4、細胞遷移和侵襲均通過Transwell法檢測。

5、蛋白質(zhì)印跡法檢測EMT相關(guān)因子(E-cadherin,Twist,Slug,MMP-7)的相對蛋白表達量。

結(jié)果：

1、MEG3表達的上調(diào)可以抑制PA細胞GH3和MMQ細胞增殖能力。

2、MEG3表達的上調(diào)可以促進垂體瘤細胞GH3和MMQ細胞凋亡。

3、MEG3表達的上調(diào)可以抑制垂體瘤細胞GH3和MMQ的細胞增殖,細胞遷移和侵襲能力。

4、MEG3表達的上調(diào)可以增加垂體瘤細胞GH3和MMQ中E-cadherin的表達,并抑制Twist,Slug和MMP-7的表達。

結(jié)論：LncRNA MEG3的上調(diào)可以促進大鼠垂體瘤細胞凋亡并抑制其增殖,遷移,侵襲和EMT。

第三部分 LncRNAMEG3靶向miR-23b-3p/FOXO4目的:探討lncRNAMEG3調(diào)控垂體瘤的分子機制。

方法：

1、在線生物學(xué)工具預(yù)測MEG3靶向的miRNA。

2、熒光素酶報告實驗檢測預(yù)測結(jié)果。

3、RNA pull down實驗檢測預(yù)測結(jié)果。

4、qRT-PCR檢測該miRNA在轉(zhuǎn)染了MEG3/NC后的GH3和MMQ細胞中的表達。

5、qRT-PCR檢測該miRNA在垂體瘤組織樣本中的表達。

6、Spearman’s相關(guān)分析計算垂體瘤組織中miRNA的表達和MEG3表達的相關(guān)性。

7、在線生物學(xué)工具預(yù)測miRNA下游的mRNA。

8、熒光素酶報告實驗驗證該預(yù)測。

9、RNA pull down實驗檢測預(yù)測結(jié)果。

10、蛋白質(zhì)印跡法和qRT-PCR均被用來轉(zhuǎn)染后的PA細胞中該基因的表達。

11、qRT-PCR檢測垂體瘤腫瘤組織中該mRNA的表達。

12、Spearman’s相關(guān)分析計算MEG3/miR-23b-3p和預(yù)測的mRNA表達的相關(guān)性。

結(jié)果：

1、LncRNA MEG3靶向miR-23b-3p。

2、在垂體瘤細胞GH3和MMQ中,上調(diào)MEG3的表達可以抑制miR-23b-3p的表達。

3、miR-23b-3p在正常組織中的表達顯著低于其在垂體瘤組織中的表達。

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