Retinal ganglion cells induce stem cell-derived neuroprotection via IL-12 to SCGF-β crosstalk

KWS：Retinal ganglion cells；stem cell；neuroprotection；IL-12；SCGF-β；crosstalk

中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）神經(jīng)元變性發(fā)生在許多疾病中，如青光眼等，這些神經(jīng)元在損傷后通常無(wú)法存活或再生。各種干細(xì)胞群已被證明可以通過(guò)其分泌組促進(jìn)神經(jīng)保護(hù)。例如，來(lái)自間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）的分泌組已被證明在心血管、泌尿生殖系統(tǒng)和腫瘤疾病的再生治療中具有巨大潛力，并且在包括缺血性、創(chuàng)傷性和炎癥性在內(nèi)的多種損傷下，在整個(gè) CNS 中顯示出神經(jīng)保護(hù)能力。特別是，在實(shí)驗(yàn)性青光眼模型中，MSCs 通過(guò)分泌血小板衍生生長(zhǎng)因子（PDGF）等神經(jīng)保護(hù)因子來(lái)促進(jìn)宿主視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞（RGC）存活。

研究發(fā)現(xiàn)，多能干細(xì)胞（iPSCs）是神經(jīng)保護(hù)的另一種有效來(lái)源，至少部分是通過(guò)分泌尚未確定的可擴(kuò)散神經(jīng)保護(hù)因子來(lái)實(shí)現(xiàn)的?？紤]到體內(nèi)干細(xì)胞移植的轉(zhuǎn)化挑戰(zhàn)，發(fā)現(xiàn) iPSC 衍生的神經(jīng)保護(hù)因子和/或調(diào)節(jié)相關(guān)的信號(hào)通路可能是更安全、更有效的 CNS 神經(jīng)元變性治療方法，但對(duì)于受損或退化的神經(jīng)元如何與供體干細(xì)胞相互作用以最大限度地提高自身存活率知之甚少。

基于此，上海視覺(jué)損害與重建重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室及斯坦福大學(xué)醫(yī)學(xué)院斯賓塞視覺(jué)研究中心聯(lián)合團(tuán)隊(duì)進(jìn)行了深入研究，通過(guò)建立一個(gè)細(xì)胞間相互作用模型，發(fā)現(xiàn)了 iPSCs 對(duì) RGCs 的神經(jīng)保護(hù)作用，并確定了介導(dǎo)神經(jīng)元誘導(dǎo)的干細(xì)胞衍生神經(jīng)保護(hù)的關(guān)鍵信號(hào)分子。研究成果發(fā)表于 Stem Cell Research & Therapy 期刊題為“Retinal ganglion cells induce stem cell-derived neuroprotection via IL-12 to SCGF-β crosstalk”。

作為非增殖性細(xì)胞，一旦在體內(nèi)分離，即使在精細(xì)的培養(yǎng)條件下，RGCs 也會(huì)逐漸自行死亡。實(shí)驗(yàn)首先檢測(cè)了 iPSC 上清液是否直接促進(jìn) RGC 體外存活。5 天后，未觀察到響應(yīng) iPSC 培養(yǎng)上清液的 RGC 活性變化。這與之前的研究結(jié)果一致，iPSC-RGC 間接共培養(yǎng)顯著提高了 RGC 的活力。這些結(jié)果表明，iPSC-RGC 相互作用，而不是單獨(dú)培養(yǎng)的 iPSCs，促進(jìn)了 RGC 的存活。

然后，驗(yàn)證 RGC 衍生的分泌組是否誘導(dǎo) iPSCs 保護(hù) RGCs。在各種特定的條件培養(yǎng)基中培養(yǎng) 5 天后（圖1 A）中，僅在 iPSC 衍生的上清液中觀察到 RGC 活性的顯著增加，其中 iPSCs 被 RGC 條件培養(yǎng)基刺激（圖1 B）。值得注意的是，沒(méi)有 RGC 衍生刺激的 RGC 條件培養(yǎng)基和 iPSC 條件培養(yǎng)基的組合對(duì) RGC 存活沒(méi)有影響（圖1 B）。因此，iPSC 的神經(jīng)保護(hù)作用是由與 RGC 共培養(yǎng)或來(lái)自 RGC 的可溶性信號(hào)誘導(dǎo)的。

圖1    RGC 上清液誘導(dǎo) iPSC 的神經(jīng)保護(hù)作用。

根據(jù)上述發(fā)現(xiàn)，進(jìn)一步確定負(fù)責(zé) iPSC 衍生的 RGC 神經(jīng)保護(hù)的候選信號(hào)。通過(guò)基于多重抗體的檢測(cè)對(duì) RGC-iPSC 條件培養(yǎng)基和 iPSC 條件培養(yǎng)基中 47 種細(xì)胞因子的濃度進(jìn)行測(cè)試，結(jié)果觀察到干細(xì)胞生長(zhǎng)因子-β（SCGF-β）濃度顯著升高。此外，使用 RT-qPCR 在 RGCs 中未檢測(cè)到 CLEC11A（SCGF 編碼基因）mRNA，表明檢測(cè)到的 SCGF-β 來(lái)源于 iPSCs。

然后，探討了人類 iPSC 衍生的 SCGF-β 是否足以且必要的參與 iPSC 誘導(dǎo)的 RGC 神經(jīng)保護(hù)。培養(yǎng) 5 天后，在含有 10 ng/mL  SCGF-β 的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的 RGCs 中觀察到 RGC 活性顯著增加。相比之下，在 RGC 共培養(yǎng)試驗(yàn)中，與對(duì)照 iPSC 系相比，CLEC11A-KO iPSCs 對(duì) RGC 存活的促進(jìn)作用顯著降低。因此，SCGF KO 耗盡了 iPSCs 的神經(jīng)保護(hù)能力。此外，還檢測(cè)了 SCGF-β 是否促進(jìn)視神經(jīng)壓迫后 RGC 的體內(nèi)存活，并發(fā)現(xiàn)在用 SCGF-β 治療的小鼠中，視神經(jīng)壓迫后 5 天，RBPMS+ RGC 密度顯著增加，證明了 SCGF-β 的體內(nèi)神經(jīng)保護(hù)能力。

接下來(lái)，為了探索 RGC 介導(dǎo)的這種 iPSC神經(jīng)保護(hù)性表型誘導(dǎo)和 iPSC SCGF-β 釋放上調(diào)的分子基礎(chǔ)，再次使用了基于多重抗體的測(cè)定。在 23  種小鼠細(xì)胞因子中，白細(xì)胞介素12（p70）在RGC 上清液中檢測(cè)到，而在 RGC 培養(yǎng)基中未檢測(cè)到（圖2 A）。這一發(fā)現(xiàn)通過(guò) ELISA 進(jìn)一步得到驗(yàn)證（圖2 B）。在 iPSC 培養(yǎng)物中發(fā)現(xiàn) SCGF-β 分泌的劑量依賴性誘導(dǎo)，且在 5 ng/mL 的 IL-12（p70）處達(dá)到峰值（圖2 C）。RT-qPCR 同樣顯示，IL-12（p70）處理后 iPSCs 中 CLEC11A mRNA 表達(dá)顯著增加，具有相同的峰值（圖2 D）。重要的是，IL-12（p70）不會(huì)直接促進(jìn) RGC 存活，直到濃度比誘導(dǎo) iPSC 分泌 SCGF-β 的濃度高 16 倍（圖2 E）。因此，RGC 衍生的 IL-12（p70）上調(diào) iPSC 的 SCGF-β 表達(dá)和分泌。

圖2    RGC 通過(guò) IL-12（p70）增強(qiáng) iPSC 的 SCGF β釋放。

從qRT-PCR 結(jié)果中，發(fā)現(xiàn)神經(jīng)生成素2（ngn2）是一種關(guān)鍵的神經(jīng)發(fā)生調(diào)節(jié)因子，在與 iPSCs 共培養(yǎng)的 RGCs 以及用 SCGF-β 處理的 RGCs 中顯著上調(diào)。這些發(fā)現(xiàn)提出了 ngn2 參與 iPSC 衍生的 SCGF-β 的神經(jīng)保護(hù)作用的假設(shè)。通過(guò)外源性表達(dá)，ngn2 在體外 1 周后導(dǎo)致 RGC 活性顯著增加。相反，在 ngn2 敲低的 RGCs 中 SCGF-β 的 RGC 保護(hù)作用丟失。這些結(jié)果表明，ngn2 是 SCGF-β 促進(jìn) RGC 體外存活的必要和充分條件。

最后，檢測(cè)了 ngn2 是否足以在體內(nèi)促進(jìn) RGC 神經(jīng)保護(hù)。實(shí)驗(yàn)觀察到，視神經(jīng)損傷2周后，玻璃體內(nèi)注射 AAV2-ngn2 的小鼠 RBPMS+ RGC 密度顯著增加（圖3 A、B），表明 ngn2 過(guò)表達(dá)可保護(hù)視神經(jīng)損傷后 RGC 的存活。

考慮到這種對(duì)內(nèi)源性 RGCs 的神經(jīng)保護(hù)作用，進(jìn)一步探討了在成年大鼠玻璃體內(nèi)移植的 RGCs 中過(guò)表達(dá) ngn2 是否會(huì)增加供體細(xì)胞的存活率。許多活的 RGCs 在不規(guī)則的群體中被發(fā)現(xiàn)，而其他的則廣泛分散（圖3 C）。移植的 ngn2 過(guò)表達(dá)的 RGCs 顯示出明顯更高的存活率（圖3 D）。ngn2 的過(guò)表達(dá)還延長(zhǎng)了移植 RGCs 的平均神經(jīng)突長(zhǎng)度（圖3 E）。因此，ngn2 過(guò)表達(dá)促進(jìn) RGC 在體內(nèi)存活，包括視神經(jīng)損傷后的宿主 RGCs 和視網(wǎng)膜移植后的供體 RGCs。

圖3    ngn2 的過(guò)表達(dá)可保護(hù)內(nèi)源性和移植的 RGC。

圖4    RGC 衍生的 IL-12（p70）激活 iPSCs 分泌 SCGF-β，然后通過(guò)上調(diào) ngn2 介導(dǎo) RGC 神經(jīng)保護(hù)。

綜上所述，該研究確定了 iPSC 衍生的 SCGF-β 和 RGC 中 ngn2 的下游誘導(dǎo)對(duì)干細(xì)胞的神經(jīng)保護(hù)作用至關(guān)重要，并進(jìn)一步證明退化的 RGC 通過(guò)其分泌的 IL-12（p70）向 iPSC 發(fā)出信號(hào)，使其具有神經(jīng)保護(hù)表型。這項(xiàng)研究指出了一種新的信號(hào)通路，即 IL-12（p70）-SCGF-β-ngn2 信號(hào)軸，受損的神經(jīng)元通過(guò)該通路與干細(xì)胞相互作用以調(diào)用自身的神經(jīng)保護(hù)。

參考文獻(xiàn)：Xia Q, Chang KC, Sun Y, Nahmou M, Noro T, Cheng Y, Kong X, Mo X, Goldberg JL, Wu S. Retinal ganglion cells induce stem cell-derived neuroprotection via IL-12 to SCGF-β crosstalk. Stem Cell Res Ther. 2025 Feb 25;16(1):90. doi: 10.1186/s13287-025-04198-5. PMID: 40001251; PMCID: PMC11863831.

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