1. 細(xì)胞準(zhǔn)備

- 人多能干細(xì)胞（hESCs）分化為SC-islets：

- 使用H1 hESCs，按照七步分化步驟進(jìn)行分化。

- 在第21天，將細(xì)胞用Accutase消化，重新聚集在低附著6孔板中，濃度為3×10?細(xì)胞/孔。

- 在第22天，將細(xì)胞聚集物轉(zhuǎn)移到新的低附著6孔板中，并在118 rpm下振蕩培養(yǎng)。

- 繼續(xù)培養(yǎng)至第39天，用于后續(xù)的共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。

- 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）：

- 購(gòu)自Lonza，使用EGM-2培養(yǎng)基培養(yǎng)。

- 在第2代時(shí)，用表達(dá)Azurite Blue的慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)ECs，用于血管網(wǎng)絡(luò)可視化。

- 人肺成纖維細(xì)胞（NHLFs）： 購(gòu)自Lonza，使用FGM-2培養(yǎng)基培養(yǎng)。

2. SC-islets的重聚集

- 將SC-islets用Accutase消化成單細(xì)胞，然后以約1000個(gè)細(xì)胞/微孔的密度接種到BSA包被的微孔平臺(tái)（StemFIT 3D）中。

- 允許細(xì)胞在微孔中重新聚集至少2天，形成直徑小于200微米的SC-islet簇。

3. 3D血管化SC-islet類器官的組裝

- 制備3D纖維蛋白凝膠：

- 將纖維蛋白原粉末溶解在EBM培養(yǎng)基中，濃度為2 mg/ml。

- 將100個(gè)重聚集的SC-islets和2×10?個(gè)分離的ECs和FBs（1:1比例）懸浮在100 µl纖維蛋白原溶液中。

- 將細(xì)胞混合物與16 µl的50 U/ml凝血酶混合，形成凝膠。

- 凝膠培養(yǎng)：

- 將混合物倒入24孔板中，形成圓形凝膠滴。

- 在37℃下聚合30分鐘。

- 在凝膠上添加不同的共培養(yǎng)培養(yǎng)基（見(jiàn)表S1），維持4-7天。

4. 共培養(yǎng)條件優(yōu)化

- 培養(yǎng)基調(diào)整：

- 測(cè)試了不同比例的血管化培養(yǎng)基（VM）和SC-islet培養(yǎng)基（IM）對(duì)細(xì)胞存活的影響。

- 確定75% VM + 25% IM的混合培養(yǎng)基能夠支持血管網(wǎng)絡(luò)的形成，但會(huì)降低SC-β細(xì)胞的胰島素含量。

- 采用逐步培養(yǎng)基變化（GM1）：從75% VM + 25% IM逐漸過(guò)渡到100% IM，以維持胰島素含量。

- 細(xì)胞共培養(yǎng)：

- 在3D纖維蛋白凝膠中，將SC-islets與ECs和FBs共培養(yǎng)。

- 在GM1條件下培養(yǎng)5天，觀察到ECs和FBs能夠形成完整的血管網(wǎng)絡(luò)，且SC-islets保持胰島素含量。

5. 微流控設(shè)備中的血管化SC-islet類器官

- 設(shè)備制備：（略）

- 小編推薦使用成熟商品化的Kirkstall Quasi Vivo多細(xì)胞共培養(yǎng)微流控設(shè)備，通道通過(guò)組織室連接。

- 細(xì)胞加載：

- 將纖維蛋白原溶液（5 mg/ml）與0.15 U/ml抑肽酶和0.2 mg/ml纖維連接蛋白混合。

- 將100-130個(gè)SC-islets、35×103個(gè)ECs和FBs（1:1比例）懸浮在5 µl纖維蛋白原-纖維連接蛋白溶液中，與1.2 µl的50 U/ml凝血酶混合后，加載到組織室中。

- 在37℃下孵育10分鐘，然后用纖維連接蛋白涂覆上下通道，再孵育15分鐘。

- 血管形成與培養(yǎng)：

- 在組織室中添加培養(yǎng)基，通過(guò)交替改變四個(gè)儲(chǔ)液池中的培養(yǎng)基體積，誘導(dǎo)血管形成和與通道的吻合。

- 在第5天，使用70 kDa熒光素-葡聚糖測(cè)試血管的通透性。

- 在微流控設(shè)備中維持共培養(yǎng)長(zhǎng)達(dá)7天，使用表S2中的培養(yǎng)條件。

6. 功能驗(yàn)證

- Ca2?成像：

- 使用GCaMP6f-hESCs生成的SC-islets，通過(guò)活細(xì)胞染色和免疫熒光染色，監(jiān)測(cè)SC-β細(xì)胞的Ca2?信號(hào)。

- 在低葡萄糖（2.8 mM）、高葡萄糖（16.8 mM）和Exendin-4（10 nM）刺激下，記錄Ca2?信號(hào)。

- 胰島素分泌檢測(cè)：

- 使用Biorep灌流系統(tǒng)進(jìn)行動(dòng)態(tài)胰島素分泌檢測(cè)。

- 測(cè)量不同刺激條件下的C肽含量，評(píng)估胰島素分泌功能。

7. 單細(xì)胞RNA測(cè)序分析

- 對(duì)SC-islets和微流控設(shè)備中的ECs和FBs進(jìn)行單細(xì)胞RNA測(cè)序。

- 使用CellChat分析細(xì)胞間通信網(wǎng)絡(luò)，預(yù)測(cè)ECs和SC-β細(xì)胞之間的信號(hào)通路，如BMP4信號(hào)。

通過(guò)以上步驟， Maike Sander et al.成功構(gòu)建了血管化的三維SC-islet類器官模型，并驗(yàn)證了其在模擬胰島功能和疾病模型中的潛力。

附：微流控設(shè)備中血管形成的具體操作步驟如下：

（1）. 微流控芯片的設(shè)計(jì)與制備（略）

- 小編推薦使用成熟商品化的Kirkstall Quasi Vivo 動(dòng)態(tài)3D活細(xì)胞自動(dòng)化微流控設(shè)備

（2）. 基質(zhì)膠的制備與灌注

- 基質(zhì)膠預(yù)處理：將基質(zhì)膠預(yù)聚液放置于4°C冰上過(guò)夜，使其充分融化。同時(shí)將移液器、吸頭和微流控芯片提前預(yù)冷。

- 灌注基質(zhì)膠：將融化的基質(zhì)膠與無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基按1:1比例混合，用預(yù)冷的移液器吸取10μL混合液，從微流控芯片中間通道的入口處輕輕注入。

- 凝膠形成：將灌注好的微流控芯片放置于37°C培養(yǎng)箱中孵育30分鐘，使基質(zhì)膠充分聚合形成凝膠。

（3）. 細(xì)胞接種與培養(yǎng)

- 細(xì)胞懸液制備：制備高密度的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）懸液，濃度為10?個(gè)/mL，與基質(zhì)膠預(yù)聚液按1:1（v/v）混勻。

- 細(xì)胞接種：將HUVEC-Matrigel混合懸液注入微流控芯片的中間通道，置于37°C孵箱中孵育30分鐘，形成包埋有細(xì)胞的基質(zhì)膠網(wǎng)絡(luò)。

- 培養(yǎng)基添加：在兩側(cè)通道中加入含有促血管生長(zhǎng)因子（如VEGF、bFGF和EGF各10ng/mL）的DMEM培養(yǎng)基，為細(xì)胞生長(zhǎng)提供營(yíng)養(yǎng)。

（4）. 血管生成與觀察

- 細(xì)胞活性檢測(cè)：培養(yǎng)3天后，使用鈣黃綠素和碘化丙啶進(jìn)行雙染，考察細(xì)胞活性狀態(tài)。

- 細(xì)胞遷移與管樣結(jié)構(gòu)形成：在促血管生長(zhǎng)因子濃度梯度的誘導(dǎo)下，觀察內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和管樣結(jié)構(gòu)形成情況。每隔12小時(shí)換液一次，維持濃度梯度。

- 成像與分析：利用相差顯微鏡或熒光顯微鏡觀察細(xì)胞的遷移和管樣結(jié)構(gòu)形成情況，使用ImageJ軟件計(jì)算細(xì)胞的最長(zhǎng)遷移距離和遷移面積。

（5）. 內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)襯與管腔形成

- 內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)襯：在微流控通道中，用層粘連蛋白包被通道，隨后將高濃度的內(nèi)皮細(xì)胞通入，使細(xì)胞均勻粘附在管腔壁上。

- 管腔形成：在細(xì)胞培養(yǎng)液層流剪切應(yīng)力的作用下，24小時(shí)后，內(nèi)皮細(xì)胞增殖并形成單層，構(gòu)建模擬靜動(dòng)脈的大血管的內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)襯的管腔。

通過(guò)上述步驟，可以在微流控設(shè)備中成功構(gòu)建血管網(wǎng)絡(luò)，用于模擬體內(nèi)血管生成過(guò)程和相關(guān)研究。

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