一、基本信息

1. 分子組成與結(jié)構(gòu)

• 豬去氧膽酸（Hyodeoxycholic Acid, HDCA）

• 是一種天然膽汁酸，化學(xué)名為 3α,6α- 二羥基 - 5β- 膽烷酸，分子式為 $C_{24}{H}_{40}{O}_4$，分子量 392.57。

• 結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：具有甾核骨架，3 位和 6 位羥基（-OH）、17 位戊酸側(cè)鏈，分子呈兩親性（疏水性甾環(huán) + 親水性羥基），參與脂類消化、肝腸循環(huán)及信號通路調(diào)控（如激活 FXR、TGR5 受體）。

• 生物素標(biāo)記原理
  通過化學(xué)偶聯(lián)將生物素（維生素 H）連接至 HDCA 的羥基、羧基或氨基（需引入氨基修飾），形成生物素 - 膽汁酸共軛物，保留 HDCA 的生物活性并賦予其親和素靶向識別能力。

二、制備方法

1. 關(guān)鍵步驟與試劑

（1）HDCA 的活化

• 羧基活化（針對 17 位戊酸側(cè)鏈）：

• 試劑：碳化二亞胺（如 EDC）+ N - 羥基琥珀酰亞胺（NHS），形成 NHS 酯中間體，便于與生物素氨基反應(yīng)。

• 反應(yīng)式：$\text{HDCA-COOH}+\text{EDC/NHS}\to \text{HDCA-NHS酯}+\text{EDC副產(chǎn)物}$

• 羥基活化（針對 3α/6α 羥基）：

• 試劑：甲磺酰氯（MsCl）或?qū)妆交酋Ｂ龋═sCl），將羥基轉(zhuǎn)化為磺酸酯（-OTs/-OMs），再與生物素氨基發(fā)生親核取代反應(yīng)。

（2）生物素偶聯(lián)

• 生物素衍生物選擇：

• 生物素 - 氨基（Biotin-NH?）：與活化的 HDCA 羧基（通過 NHS 酯）或磺酸酯（羥基活化后）反應(yīng)，形成酰胺鍵或醚鍵。

• 生物素 - 馬來酰亞胺（Biotin-Maleimide）：若 HDCA 經(jīng)修飾引入巰基（-SH），可通過硫醚鍵偶聯(lián)。

• 典型反應(yīng)條件：

• 溶劑：DMSO/DMF（助溶 HDCA），pH 7.5-9.0（弱堿性促進(jìn)氨基反應(yīng)），室溫?cái)嚢?2-6 小時(shí)。

（3）純化與表征

• 純化：硅膠柱層析（氯仿 - 甲醇梯度洗脫）或制備型 HPLC（反相柱，流動相含 0.1% 甲酸水溶液 - 乙腈）。

• 結(jié)構(gòu)驗(yàn)證：

• 質(zhì)譜（MS）：ESI-MS 檢測分子離子峰（[M+H]+ 或 [M-H]-），確認(rèn)生物素（分子量 244.31）與 HDCA 的加合。

• 核磁共振（NMR）：1H-NMR 觀察生物素咪唑環(huán)（δ≈7.0-7.5 ppm）或側(cè)鏈亞甲基（δ≈1.0-2.5 ppm）特征峰。

三、特性與優(yōu)勢

1. 雙功能分子特性

• 膽汁酸生物活性保留：標(biāo)記后仍能結(jié)合 FXR/TGR5 受體，調(diào)控脂質(zhì)代謝、炎癥反應(yīng)等通路，適用于受體介導(dǎo)的機(jī)制研究。

• 生物素靶向性：通過親和素 - 生物素高親和力結(jié)合（Kd≈10?1? M），實(shí)現(xiàn)對 HDCA 的追蹤、捕獲或信號放大。

2. 高穩(wěn)定性與兼容性

• 甾核結(jié)構(gòu)剛性強(qiáng)，生物素連接鍵（如酰胺鍵、醚鍵）在生理?xiàng)l件下不易斷裂，適合體內(nèi)外長時(shí)間孵育實(shí)驗(yàn)（如細(xì)胞成像、動物活體追蹤）。

• 可兼容多種檢測技術(shù)：熒光標(biāo)記親和素（如 Alexa Fluor 系列）、酶標(biāo)親和素（HRP/AP）或磁珠偶聯(lián)親和素，滿足不同實(shí)驗(yàn)需求。

3. 應(yīng)用靈活性

• 小分子探針：用于研究 HDCA 的肝腸循環(huán)路徑、細(xì)胞攝取機(jī)制（如肝細(xì)胞 / 腸道上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)體識別）。

• 藥物載體組件：與納米顆粒（如脂質(zhì)體、聚合物膠束）結(jié)合，利用膽汁酸的肝靶向性（肝細(xì)胞高表達(dá)膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)體）和生物素親和性，實(shí)現(xiàn)肝部疾病的雙重靶向給藥。

四、應(yīng)用領(lǐng)域

1.膽汁酸代謝與信號通路研究

• 受體結(jié)合分析：通過生物素標(biāo)記 HDCA 進(jìn)行親和層析，釣取細(xì)胞內(nèi) FXR/TGR5 受體或其他互作蛋白，闡明 HDCA 調(diào)控代謝的分子機(jī)制。

• 肝腸循環(huán)追蹤：在動物模型（如小鼠）中注射標(biāo)記物，利用親和素磁珠從膽汁、糞便或血漿中捕獲 HDCA，定量分析其排泄與重吸收效率。

2. 分析檢測技術(shù)

• ELISA 檢測：作為競爭抗原，檢測生物樣品中內(nèi)源性 HDCA 或外源性藥物濃度。

• 免疫熒光成像：標(biāo)記物與熒光親和素聯(lián)用，在組織切片或活細(xì)胞中可視化 HDCA 的分布（如肝細(xì)胞內(nèi)吞囊泡定位）。

3. 腸道微生物互作研究

五、注意事項(xiàng)

1. 標(biāo)記位點(diǎn)對活性的影響

• 優(yōu)先選擇非活性位點(diǎn)連接生物素：如 17 位羧基（遠(yuǎn)離羥基功能團(tuán)），避免影響 HDCA 與受體的結(jié)合能力。通過分子對接模擬驗(yàn)證標(biāo)記后構(gòu)象變化。

2. 溶解性優(yōu)化

• HDCA 水溶性差（≈0.1 mg/mL），標(biāo)記反應(yīng)需使用有機(jī)溶劑（如 DMSO≤10%），并在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中逐步稀釋至生理環(huán)境，避免細(xì)胞毒性。

3. 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)安全性

• 在動物研究中需評估標(biāo)記物的毒性：生物素本身毒性低，但共軛物可能因分子量增大影響肝腎功能，建議通過血生化指標(biāo)（如 ALT、AST）監(jiān)測。

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