羅氏實時熒光定量PCR儀工作原理詳解

一、引言

聚合酶鏈式反應（Polymerase Chain Reaction，PCR）自上世紀80年代問世以來，極大地推動了分子生物學、醫學檢測、環境監測、法醫學和食品安全等多個領域的發展。傳統PCR的終點分析具有一定的局限性，僅能判斷是否擴增成功，難以實現實時監控與定量分析。實時熒光定量PCR（Real-time Quantitative PCR，qPCR）技術應運而生，解決了這一問題。

羅氏公司研發的 LightCycler® 系列實時熒光定量PCR儀，基于實時熒光檢測與熱循環技術，集成了溫控系統、光學檢測模塊及數據處理系統。本文將系統介紹其工作原理、技術結構及相關參數，為理解儀器操作原理和合理使用提供理論依據。

二、實時熒光定量PCR的基本原理

實時熒光定量PCR儀的核心在于實時監測DNA擴增過程中熒光信號的變化，通過熒光染料或探針報告擴增產物的累積量，最終實現對初始模板的定量分析。

其基本過程包括：

1. 模板擴增（DNA復制）

2. 熒光信號產生（通過染料或探針）

3. 信號采集與分析（每一循環實時讀取）

1. 擴增原理

PCR擴增由三個基本步驟循環構成：

• 變性（Denaturation）：95°C，使雙鏈DNA解鏈為單鏈；

• 退火（Annealing）：50–65°C，引物與模板DNA特異性結合；

• 延伸（Extension）：72°C，在Taq酶作用下合成新鏈。

每一輪擴增，理論上目標序列數量會倍增，經過30–40個循環后即可達到可檢測水平。

2. 熒光標記方法

熒光定量PCR的實現依賴于熒光染料或探針系統的加入。目前主要采用以下幾種檢測體系：

• SYBR Green I染料：與雙鏈DNA結合后發出熒光，適用于通用引物體系；

• TaqMan探針：結合目標序列后被酶切斷產生熒光釋放，特異性強；

• 分子信標（Molecular Beacon）與Scorpion探針：通過構象變化實現熒光釋放；

• FRET探針：兩個探針之間發生熒光共振能量轉移，用于高特異性檢測。

3. 熒光檢測與Ct值概念

每一輪循環結束后，設備通過激發光照射樣品，記錄熒光強度變化。熒光值超過設定閾值的循環數被稱為Ct（Threshold Cycle），其與起始模板數量呈負相關關系：

• 初始模板越多，Ct值越?。?/p>

• Ct值差異可反映樣品間表達量差異。

通過繪制標準曲線或采用ΔΔCt法，可進行絕對或相對定量分析。

三、羅氏LightCycler® 系統構造與功能模塊

羅氏 LightCycler® 實時熒光定量PCR儀由以下四大模塊構成：

1. 溫控系統

構造

• 使用帕爾貼元件進行快速加熱與降溫；

• 96孔金屬模塊與熱蓋形成封閉反應環境；

• 多點溫度傳感器進行實時監控與調節。

功能

• 確保每一孔溫度一致；

• 準確執行復雜的熱循環程序；

• 快速升降溫縮短實驗時間，提高效率。

2. 光學檢測系統

光源

• 多通道激發光源（如LED）激發不同熒光染料；

• 激發波長穩定，能量可控。

檢測器

• 采用光電二極管或光電倍增管；

• 不同波段濾光片組合可實現FAM、HEX、ROX、Cy5等染料識別。

工作流程

• 在每一循環結束后，系統進行熒光激發；

• 熒光信號通過光路系統傳輸至探測器；

• 同步讀取多個通道信號，支持多重檢測。

3. 樣品托盤與反應板

• 采用標準96孔PCR板，方便兼容市場主流耗材；

• 熱蓋自動調節壓力，防止蒸發；

• 金屬材質確保良好的熱傳導性。

4. 控制與分析系統

• 通過USB或網絡接口連接控制計算機；

• 使用 LightCycler® 軟件進行程序設置、數據采集與圖像分析；

• 支持實時曲線、熔解曲線、標準曲線繪制等功能。

四、典型檢測流程解析

1. 實驗設計

• 選擇適合的熒光系統（染料或探針）；

• 設計特異性引物；

• 準備PCR反應體系（包含模板、引物、酶、dNTP等）；

2. 程序設置

在軟件中設定熱循環程序，包括：

• 預變性時間與溫度；

• 每步溫度、時間、循環次數；

• 采集熒光的通道與時間點。

3. 擴增及實時檢測

• 啟動反應，儀器自動執行升降溫與熒光采集；

• 實時生成擴增曲線，觀察反應動態；

• 監測不同通道間數據變化，判斷是否為特異性擴增。

4. 數據分析

• 提取Ct值；

• 應用ΔCt或ΔΔCt法計算表達量變化；

• 生成標準曲線用于絕對定量；

• 判斷熔解曲線是否存在非特異產物或引物二聚體。

五、熔解曲線分析原理（適用于SYBR Green法）

在擴增結束后，通過升溫過程記錄雙鏈DNA解鏈產生的熒光下降，得到熔解曲線：

• 每一個特異產物對應一個特定的熔解溫度（Tm）；

• 若存在多個Tm峰，提示可能存在非特異擴增或引物二聚體；

• 可通過曲線平滑、導數計算等方式進行圖像識別。

六、影響熒光信號準確性的因素

七、工作原理的應用示例

1. 基因表達分析

利用qPCR檢測轉錄本豐度，常用于疾病機制研究、藥效評估、轉基因檢測等。

2. 病原體檢測

檢測病毒DNA/RNA（如SARS-CoV-2、HPV、HBV等），適用于臨床診斷和大規模篩查。

3. 拷貝數變異（CNV）分析

通過對比Ct值計算基因組中某一區域的拷貝數變化，用于腫瘤研究或遺傳病篩查。

八、未來技術趨勢

雖然實時熒光PCR已趨成熟，但其工作原理不斷被擴展與優化，主要方向包括：

• 數字PCR（dPCR）：基于微液滴分隔的絕對定量技術；

• 微流控PCR芯片：小型化平臺適用于現場快速檢測；

• 自動化平臺整合：與樣品前處理、數據云分析系統協同工作。

九、結語

羅氏實時熒光定量PCR儀通過整合精確的溫控技術與多通道光學檢測系統，實現了對DNA擴增過程的實時監控與定量分析。其工作原理遵循分子生物學與物理光學的基本規律，構建出一個高效的數據生成平臺。在掌握其原理基礎上，科研人員可更加準確地設計實驗、評估數據質量，并進一步拓展其在各類分子分析中的應用潛力。