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　　【化工儀器網 科技前沿】近日，中國科學院深圳先進技術研究院研究員鄭煒團隊在高分辨雙光子顯微成像技術研發中取得系列進展。
 

　　第一項研究工作與華中科技大學教授費鵬團隊合作完成，開發出基于多幀重構提高雙光子成像軸向分辨率的方法。與傳統雙光子成像相比，該方法對成像軸向分辨率和信噪比均提升超過3倍。相關研究成果以Axial resolution improvement of two-photon microscopy by multi-frame reconstruction and adaptive optics為題，發表在Biomedical Optics Express上，深圳先進院博士葉世蔚為論文第一作者。雙光子顯微技術以其深層穿透和天然層析能力在生物成像中發揮重要作用，尤其是在大腦神經環路成像中。然而，傳統雙光子成像技術的軸向分辨率一般是幾個微米甚至更差，大于亞微米尺度的橫向分辨率，不利于分辨三維分布的一些精細結構，如神經環路上沿軸向分布的軸突、樹突和突觸等結構。
 

　　該研究中，研究人員將多幀重構算法用于雙光子成像，結合自主研發的自適應光學模塊和相位補償方法，實現雙光子成像軸向分辨率3倍提升，信噪比提升超過3倍。利用該系統，研究人員對小鼠離體腦片和活體大腦進行成像研究，觀測到一般雙光子成像無法分辨的軸向細節，包括胞體的精細連接、更加清晰的軸突邊界和小膠質突起等；實時追蹤敗血癥小鼠模型，清晰觀察到小膠質細胞的三維形態變化。該研究提供了一種三維高分辨成像技術，有利于進一步了解腦機理和診治重大腦疾病。
 

　　第二項研究工作是開發出新型自適應光學方法，用于提高雙光子成像質量。該方法使1 mm左右的深層腦組織成像時，成像分辨率提升1倍，信噪比提升5倍。相關研究成果以Adaptive optics via pupil ring segmentation improves spherical aberration correction for two-photon imaging of optically cleared tissues為題，發表在Optics Express上。深圳先進院助理研究員高玉峰為論文第一作者，副研究員李慧為論文通訊作者。雙光子顯微結合組織光透明技術能夠在樣品深層處進行亞微米級的熒光成像，這對研究神經環路、連接和功能具有重要意義。但是，組織光透明劑處理后的樣品與物鏡的標準浸潤介質的折射率不匹配，這會引入球差、降低雙光子的成像分辨率和熒光信號的強度。針對該問題，研究人員提出新型環形矯正的自適應光學方法來補償折射率不匹配，從而降低球差提高成像質量。
 

　　該方法使深層樣品(1 mm)成像時的橫向分辨率從1.27 μm提高到 0.75 μm，縱向分辨率從4 μm提高到2 μm，熒光信號強度提高5倍以上。這些參數的提高帶動雙光子成像效果的提升，使研究人員能夠觀察到光透明處理的腦片1 mm深度下的樹突棘結構。該研究提高了雙光子在光透明樣品中的成像質量，為開展腦科學和相關腦疾病的研究提供重要成像工具。
 

　　研究工作得到科技部重點研發計劃、國家自然科學基金重大科研儀器研制項目和重大研究計劃等的支持。
 

　　圖1.對Thy1-GFP-M小鼠腦片成像結果比較。四個比較面均為XZ面，TPM: 雙光子成像，AO MR-TPM：基于自適應光學和多幀重構的雙光子成像，Scale bar：10 μm
 

　　圖2.用環形矯正方法對光透明處理的Thy1-GFP-M小鼠腦片成像結果。左側，x-y平面上球差矯正前后對比；右側，x-z平面上球差矯正前后對比。Scale bar：20 μm