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天津譜祥偉業(yè)科技有限公司
初級(jí)會(huì)員 | 第14年

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反相色譜柱的使用注意事項(xiàng)總結(jié)

時(shí)間:2025/5/29閱讀:81
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我們?nèi)粘IV分析工作中,反相色譜柱的使用頻次是相對(duì)較高的,下面總結(jié)一下反相色譜柱的使用注意事項(xiàng),為廣大色譜分析工作者作參考。

反相柱的安裝與活化

新開(kāi)啟的反相色譜柱,出廠保存溶劑一般是甲醇或85%甲醇。我們拿過(guò)來(lái)先不要著急使用到具體的方法上。

1將色譜柱入口端連到液相上,用甲醇或乙腈沖柱,出口端用廢液缸接著,看出口端是否有氣泡流出(避免氣泡進(jìn)入檢測(cè)系統(tǒng)),若有氣泡,則用甲醇或乙腈沖干凈氣泡,然后再連接到檢測(cè)器入口端。

2,如果實(shí)驗(yàn)所需流動(dòng)相不含有鹽,直接切換初始梯度比例的流動(dòng)相平衡色譜柱即可;如果流動(dòng)相含有鹽,先用高比例水相(如水/乙腈=9010)過(guò)渡,然后再切換至含有鹽的流動(dòng)相初始梯度比例平衡色譜柱。

3,色譜柱平衡過(guò)程,先是柱壓逐漸平穩(wěn),然后基線走平,最后看平衡柱體積在10個(gè)柱體積以上。就可以運(yùn)行方法,進(jìn)樣檢測(cè)了。

反相流動(dòng)相及樣品的制備

 

1,有機(jī)溶劑須使用HPLC級(jí)別以上的,水盡可能使用超純水;,

2添加鹽的流動(dòng)相,須經(jīng)過(guò)孔徑≤0.45μm的濾膜過(guò)濾(濾膜確保與流動(dòng)相兼容,不會(huì)被溶解);

3,當(dāng)緩沖鹽濃度較高時(shí)(50mM以上),可以在有機(jī)相中添加一定比例的水(如乙腈/-8020),避免梯度最后有機(jī)相比例過(guò)高,造成鹽析。

4,避免單一相長(zhǎng)時(shí)間使用一瓶100%水相流動(dòng)相,水相容易滋生細(xì)菌(尤其含有緩沖鹽時(shí)),水相一般1-3天更換(更換頻次視室溫而定)。有時(shí)需要配置大量水相長(zhǎng)時(shí)間使用時(shí),可以添加3-5%的有機(jī)相,來(lái)有效抑制長(zhǎng)菌。

5,流動(dòng)相避免敞口放置,會(huì)落入灰塵、細(xì)菌,且含有有機(jī)相時(shí)會(huì)部分揮發(fā),造成比例變化,不能重現(xiàn),還會(huì)影響人員的身體健康。

6,待測(cè)樣品的制備:

我們精確稱量樣品后,盡量用初始梯度比例的流動(dòng)相去溶解到我們需要的濃度;

如果溶解性差,可以加一些助溶試劑(如DMF);

進(jìn)樣前過(guò)一下≤0.45μm的濾膜,如果樣品比較復(fù)雜,含有過(guò)多基質(zhì),可離心再過(guò)濾。

反相色譜柱的保存

1,長(zhǎng)時(shí)間不用(一周以上),盡量保存在高比例有機(jī)相中。,

2,保存前的沖洗:多數(shù)方法里會(huì)用到緩沖鹽,一般先用高比例水相將緩沖鹽沖洗干凈,再置換成高比例有機(jī)相保存,同時(shí)也將強(qiáng)保留的小極性污染物沖干凈。

 

 


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