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分析定量PCR實驗中的Ct值與Cq 值
什么是 C q值？
定量PCR實驗通常用于量化目標(biāo)序列的絕對量或比較樣本之間目標(biāo)序列的相對量。該技術(shù)通過放大過程中發(fā)出的目標(biāo)特異性熒光信號實時監(jiān)測目標(biāo)的擴(kuò)增。
盡管實時熒光定量PCR中， 熒光染料和探針 應(yīng)該是序列特異性的，但在大多數(shù)實時 PCR 實驗中會出現(xiàn)大量的背景熒光。通過閾值線和 C t值可以輕松分析背景中的熒光信號，了解 PCR的循環(huán)周期。其實，所謂的閾值線是檢測水平或反應(yīng)達(dá)到高于背景水平的熒光強(qiáng)度的點。在進(jìn)行 PCR 之前，您（或您的 PCR 儀中的軟件）設(shè)置了一個閾值水平。這實際上是圖表中的一條線，代表高于背景熒光的水平，它也在指數(shù)階段開始時與反應(yīng)曲線相交（圖 1）。
C q值是您的樣品反應(yīng)曲線與閾值線相交處的 PCR 循環(huán)數(shù)。該值表明從您的樣本中檢測到真實信號需要多少個周期。實時 PCR 運行將具有每個樣品的反應(yīng)曲線，因此會有許多 C q 值。您的 PCR 儀軟件會計算 每個樣品的 Cq值并繪制圖表。
(實時 PCR 擴(kuò)增曲線上的閾值水平和 C q 值)
C q 值與樣本中目標(biāo)核酸的數(shù)量成反比，并與樣本中的目標(biāo)拷貝數(shù)相關(guān)。較低的 C q值（通常低于 29 個循環(huán)）表示大量的目標(biāo)序列。較高的 C q 值（超過 38 個循環(huán)）意味著較低的目標(biāo)核酸量。高 C q值也可能表明目標(biāo)或 PCR 設(shè)置存在問題，如本文后面的陷阱部分所述。
您的 PCR 儀器將在每個循環(huán)中收集熒光數(shù)據(jù)。大約 15 個循環(huán)后，您將對背景熒光水平有一個很好的了解 ——這將顯示為一條從零循環(huán)點開始的直線。閾值水平將剛好高于此水平，但在您的樣品開始進(jìn)入 PCR 擴(kuò)增指數(shù)階段時。今天，計算機(jī)軟件可以計算出這個確切的點，所有現(xiàn)代實時循環(huán)儀都有一個自動閾值線設(shè)置。
實時 PCR 記錄反應(yīng)過程中發(fā)出的熒光量，此時所有 PCR 成分都非常豐富。這樣，C q 值通常在實時 PCR 中的重復(fù)之間保持一致。當(dāng)達(dá)到 PCR 反應(yīng)終點時，積累的抑制劑、失活的聚合酶和限制性試劑會在終點值上產(chǎn)生很多變化，這就是傳統(tǒng) PCR 無法定量使用的原因。
影響Cq值的相關(guān)因素有哪些？
許多因素會影響您的 C q 值。 您的樣品之間C q 值的一些差異將是由于生物事件，例如您的目標(biāo)基因響應(yīng)治療而上調(diào)/下調(diào)。然而，C q 值同樣容易受到 PCR 反應(yīng)準(zhǔn)備和 PCR 組分本身的影響。比較常見的是以下幾種情況：
1. 主混音
溶液中的 pH 值和鹽濃度會影響熒光發(fā)射。熒光發(fā)射的任何變化都會自然地改變您的 C q值。因此，請確保您只使用高質(zhì)量的 PCR 組件，如果使用自制溶液，請在每次實驗前檢查 pH 值并監(jiān)測鹽沉淀。
2. 被動參考染料
反應(yīng)值是您的 FAM（報告基因）染料與您的 ROX（被動參考）染料的熒光比率。假設(shè) FAM 熒光不變，較低量的 ROX 會產(chǎn)生較高的反應(yīng)值。
3. 反應(yīng)效率
PCR 反應(yīng)效率取決于預(yù)混液性能、引物的特異性、引物退火溫度和樣品質(zhì)量。一般來說，90% 以上的 PCR 效率是可以接受的。100% 的 PCR 效率表明感興趣的目標(biāo)序列在每個循環(huán)中加倍。 PCR 效率與模板 10 倍稀釋之間 3.3 個循環(huán)的變化相吻合。
要確定每個引物對的 PCR 效率，請使用五個 10 倍稀釋步驟對模板進(jìn)行系列稀釋，并計算 R 2 ，這是一種描述一個值預(yù)測另一個值的統(tǒng)計量度。對于接近 100% 的 PCR 效率，您的 R 2 值應(yīng)大于 0.99。
對標(biāo)準(zhǔn)曲線上的每個點至少運行三個重復(fù)。對于低拷貝數(shù)輸入，更高的重復(fù)數(shù)尤其重要，因為重復(fù)數(shù)之間的變化更有可能發(fā)生。