在雙抗體夾心法測定抗原時，如應用針對抗原分子上兩個不同抗原決定簇的單克隆抗體分別作為固相抗體和酶標抗體，則在測定時可使標本的加入和酶標抗體的加入兩步并作一步。這種雙位點一步不但簡化了操作，縮短了反應時間，如應用高親和力的單克隆抗體，測定的敏感性和特異性也顯著提高。單克隆抗體的應用使測定抗原的ELISA提高到新水平。

在一步法測定中，應注意鉤狀效應（hookeffect），類同于沉淀反應中抗原過剩的后帶現象。當標本中待測抗原濃度相當高時，過量抗原分別和固相抗體及酶標抗體結合，而不再形成夾心復合物，所得結果將低于實際含量。鉤狀效應嚴重時甚至可出現假陰性結果。

心鈉素（ANP）ELISA 試劑盒

間接法

間接法常用于檢測抗體，一般的操作步驟為：

將已知的抗原固著于塑膠孔盤上，完成后洗去多余的抗原。
加入待測檢體，檢體中若含有待測的一次抗體，則其會與塑膠孔盤上的抗原進行專一性鍵結。
洗去多余待測檢體，加入帶有酶的二次抗體，與待測的一次抗體鍵結。
洗去多余未鍵結二次抗體，加入酶底物使酶呈色，藉儀器（ELISA reader）測定塑膠盤中的吸光值（OD值），以評估有色終產物的含量即可測量待測抗體的含量。

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