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Beacon®單細胞光導系統不僅在抗體發現和細胞株開發領域已經得到了國內外工業和學術客戶的認可，在針對T細胞的單細胞功能表征的應用中也有越來越多的新研究成果發布。近期，布魯克細胞分析將陸續發布四份應用指南，與大家分享和探討Beacon®的T細胞功能表征應用在新型細胞療法的發現、驗證和轉化研究階段的應用。本期內容將帶大家再次認識Beacon®技術和提供的T細胞表型和功能的多維分析方法。

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過繼細胞療法（ACT）通過對?體或同種異體免疫細胞的工程化改造和移植，為正在進行的抗癌?爭帶來了新的治療希望[1,2]。成功開發過繼細胞療法需要在開發過程的不同階段面臨多種挑戰（圖1）。在發現階段，對CAR/TCR和抗原進行探索，以確定能夠提供針對癌細胞的有效靶向方式和有功效的候選藥物。之后的驗證階段需要對CAR-T或TCR-T進行嚴格評估以驗證其性能。最后的轉化階段包括在臨床試驗中測試有前途的候選藥物，以優化治療并評估對患者的治療影響。

圖1.細胞療法開發不同階段的目標與挑戰

接下來我們將展示布魯克的Beacon®單細胞光導平臺如何利用光流控技術和OptoSelect芯?上的NanoPen納升級小室來實現單細胞功能表征，從表型、功能（細胞因子分泌和細胞毒性）和序列等多個維度為細胞療法開發提供創新工具。

Beacon®單細胞光導平臺和工作流程

Beacon®整合了精密調控的流路系統、細胞培養系統、顯微鏡、明場和熒光成像和AI圖像算法等功能，能夠用于操作和培養加載到OptoSelect芯?上的細胞。Beacon®平臺上的軟件算法可以根據芯?通道中的細胞或者微珠的大小、形態和熒光來進行有效識別，并?動將它們加載到每個芯?上的NanoPen小室中（圖2）。通過明場和熒光濾光?進行延時成像使，研究?員能夠深入表征數千個單細胞的功能特征。Beacon®能夠根據篩選條件?動導出具有特定功能的細胞，以用于開展測序等下游分析。與其他依賴液滴或微孔的單細胞技術相比，Beacon®在細胞的連續培養和表征上具備明顯優勢：流路系統讓新鮮培養基持續注入到NanoPen上方的通道中，從?允許氧?、營養物和細胞代謝廢物通過濃度梯度擴散進行有效交換，讓細胞維持在健康生理狀態下完成多種檢測和長時間的追蹤（圖2）。

圖2. Beacon®系統和OptoSelect芯片上工作流程

動態單細胞層面細胞毒性測定

針對腫瘤靶細胞的細胞毒性是CD8+ T細胞的關鍵功能標志。使用傳統的細胞毒性檢測，例如鉻釋放測定或活/死細胞染?法等僅測量固定時間點的平均細胞殺傷率[6]。在單細胞?平上檢測細胞毒性可更細致地了解T細胞功能異質性。這種在單細胞分辨率下的動態追蹤將解釋細胞毒性的動?學，能夠展?不同的細胞殺傷行為，例如快速殺傷的迅速響應的和慢速殺傷的持續作用（圖3）。把這些數據與臨床特征聯系起來，將有助于我們加深對于過繼細胞療法復雜動態特征的理解。

圖3. Beacon®上開展單細胞層面細胞毒性分析

單細胞多重細胞因?分泌測定

單細胞層面細胞因?的功能性分泌已被證明是癌癥免疫治療療效的有效預測因?[7-9]。Beacon®能夠檢測三種客戶自定義的細胞因子。布魯克的IsoSpark/ IsoLight單細胞功能蛋白質組學分析平臺能夠提供30+種細胞因?分泌分析，可幫助識別驅動細胞功能的關鍵細胞因?[10]。Beacon®平臺可將?組微珠加載到NanoPen室中以捕獲活細胞分泌出的細胞因?。然后在NanoPen室中導入單個T細胞和靶細胞或刺激物（如CD3/ CD28微珠）。經過過夜的孵育后，使用?抗在芯?上處理微珠，并利用不同熒光通道的圖像捕獲以直接揭?單個T細胞的細胞因?分泌?平（圖4）。通過檢測T細胞在特定刺激下的單細胞分泌為研究者提供有探索價值的數據，并為了解功能性細胞因?分泌的機制創造了機會。

圖4. Beacon®上開展T細胞三重細胞因子分泌測定

基于細胞表?標志物的表型測定

Beacon®可利用熒光來檢測T細胞或靶細胞上是否表達特異表?標志物，用于選擇性導入目標細胞導或對導入后的細胞分析其表面標志物（圖5）。儀器能夠選擇性地將特定表型細胞加載到NanoPen室中。光流控技術直接在NanoPen室中設置細胞進行功能測定，與FACS和其他細胞分選技術相比，需要更少的細胞。相比于FACS使細胞承受?流速和剪切應?[11]，光流控技術依賴于將光照射在芯?上產生電場來輕輕推動細胞，減少細胞受損。細胞導入后，還可以在細胞毒性和細胞因?測定過程中進行表?標志物染?，以提供有關表?表型的附加數據。例如，CD69或CD137染?可揭?具有細胞功能的細胞激活。相似地，可對細胞耗竭、持久性或共刺激等標志物進行染?。

圖5. Beacon®用于細胞表面標志物和表型分析

整合多維分析結果，全?了解單細胞功能

Beacon®可以同時進行三重細胞因?分泌、細胞毒性和表?標志物測定。對同?單細胞進行所有三種測定揭?了功能之間的復雜關系，這是使用傳統方法?法獲得的：通過分析細胞因?分泌和細胞毒性，揭?細胞殺傷是否與所分析的細胞因?相關。添加表?標志物分析將激活或耗竭等變量與殺傷潛?和細胞因?分泌聯系起來。將Beacon®平臺生成數據用于創建多維可視化，區分具有不同功能特征的細胞群（圖6）。探索細胞群體的功能異質性揭?對細胞行為的深入見解，這將為理解ACT性能的提供關鍵信息。

圖6. 根據細胞功能特征進行分群

細胞導出和下游分析

Beacon®平臺對活細胞進行后，研究者可以找到值得進?步研究的細胞。利用光將NanoPen室中找到感興趣的細胞并將其導出到96孔板中。然后可以使用多種技術（例如TCR-seq或scRNA-seq）對細胞進行分析，以揭?細胞的TCR或轉錄組圖譜（圖7）。這些多組學見解直接揭?了單細胞?平上細胞功能的基因組和轉錄組驅動因素[12]。成功利用Beacon®平臺的導出功能可以深入了解為什么某些細胞比其他細胞功能更強，從?識別關鍵機制，加速對癌癥免疫療法的理解和開發。

圖7. Beacon®上目標細胞回收

更多檢測

除了以上的分析方法，利用Beacon®的單細胞培養和延時拍照，研究者還能夠對NanoPen室中細胞的數量進行計數追蹤，以分析細胞增殖能?。將多個靶細胞與T細胞?起導入NanoPen室中，則可以揭?T細胞是否具有連續殺死多個靶細胞的能力。計算靶細胞和T細胞之間的距離可用于生成有關運動、趨化性和突觸形成的數據。Beacon®平臺的靈