熒光定量PCR儀器操作指南：從樣本準備到數據解析@2024全國包郵JD-PCR16，山東競道廠家介紹，熒光定量PCR(qPCR)是一種高靈敏度和高特異性的核酸檢測技術，廣泛用于基因表達分析、病原體檢測和基因分型等研究。以下是熒光定量PCR儀器的操作指南，涵蓋從樣本準備到數據解析的整個過程。

　　**1. 樣本準備**

　　- **樣本收集**：根據實驗要求，從生物樣本中提取核酸。常見樣本包括血液、組織、細胞培養液等。確保使用無菌和適當的工具，以防樣本污染。

　　- **核酸提取**：使用專門的核酸提取試劑盒或方法，提取樣本中的DNA或RNA。提取過程應按照試劑盒說明書進行，以確保核酸的純度和質量。

　　- **核酸定量**：使用分光光度計或熒光測定儀定量核酸濃度。定量結果用于后續PCR反應體系的配制，確保實驗的準確性。

　　**2. PCR反應體系準備**

　　- **反應體系配制**：準備qPCR反應混合物，包括：

　　- **DNA/RNA模板**：根據定量結果添加適量模板。

　　- **PCR緩沖液**：提供反應所需的離子環境。

　　- **引物(Primers)**：特異性識別目標序列的短鏈DNA。

　　- **探針或染料**：用于實時監測擴增過程中的熒光信號。

　　- **DNA聚合酶**：催化DNA合成的酶。

　　- **dNTPs**：核苷酸三磷酸，提供DNA合成所需的基本單元。

　　- **反應體系混合**：在無RNA酶的環境下，將各組分混合均勻。確保反應液的均勻性，以提高實驗結果的重復性。

　　**3. qPCR儀器設置**

　　- **樣本加載**：將準備好的反應混合物分裝到PCR管或PCR板中。每個管或孔中都需要設置對照組和實驗組。

　　- **設置程序**：根據實驗需求，在qPCR儀器的軟件中設置PCR程序。常見程序包括：

　　- **變性階段**：通常在95°C進行，持續1-2分鐘。

　　- **退火階段**：通常在55-65°C進行，持續20-30秒。退火溫度根據引物的熔解溫度(Tm)進行設置。

　　- **延伸階段**：通常在72°C進行，持續30秒-1分鐘。根據DNA聚合酶的要求設置時間。

　　- **熒光檢測**：設置熒光信號采集時間點，通常在擴增的每一個循環結束時進行。選擇合適的熒光染料或探針，根據實驗要求監測信號變化。

　　**4. 數據解析**

　　- **數據獲取**：運行qPCR程序后，儀器會自動生成熒光曲線和擴增曲線。熒光曲線顯示了每個樣本的熒光信號強度隨循環次數的變化情況。

　　- **閾值設置**：在數據分析軟件中設置熒光信號閾值，確定目標基因的擴增起始點。閾值設置過低可能導致假陽性，設置過高則可能遺漏真實信號。

　　- **Ct值計算**：軟件會計算每個樣本的Ct值(循環閾值)，即熒光信號超過閾值所需的循環次數。Ct值與目標基因的初始量呈負相關，Ct值越低，初始量越高。

　　- **結果分析**：通過比較實驗組與對照組的Ct值，計算目標基因的相對表達量或拷貝數。使用標準曲線法或ΔCt法進行定量分析。

　　- **數據解讀**：根據實驗設計和目標，解讀實驗結果。分析數據時需考慮實驗重復性和潛在的技術誤差，確保結果的可靠性。

　　**總結**

　　熒光定量PCR(qPCR)儀器的操作涉及樣本準備、反應體系配制、儀器設置和數據解析四個主要步驟。通過嚴格按照操作指南進行每一步，能夠確保實驗的準確性和可靠性。定期維護和校準儀器、熟練掌握數據分析方法也是確保實驗成功的關鍵因素。