埃德曼測序的原理

埃德曼降解法測序（Edman degradation sequencing）誕生于二十世紀五十年代，是由瑞典化學家 Pehr Edman 提出并不斷完善的一種經典蛋白質 N 端序列分析技術。該方法利用苯異硫氰酸酯（PITC）在弱堿性環境下與肽鏈 N 端 α-氨基發生選擇性縮合，形成可溶于有機溶劑的苯硫代氨基甲酰（PTC）衍生物；隨后在酸性條件下促使衍生肽的第一殘基從肽鏈中環化并裂解生成可鑒定的雙環衍生物（ATZ-氨基酸），經異構化和質譜或高效液相色譜分離即可確定該殘基的化學身份。循環往復，研究者便可逐步“剝洋蔥"式地讀取多肽的線性序列。由于化學反應嚴格依賴游離 α-氨基，Edman 測序可在毫微摩爾量級的樣品上實現單殘基分辨率，回收率理論上可達 98 %/cycle。它尤其適用于定位成熟蛋白 N 端、驗證翻譯后修飾是否遮蔽起始殘基、確認免疫印跡條帶或 SDS-PAGE 純化條帶中的目標蛋白身份。當研究對象為 3 kDa—30 kDa 的純化肽段或膠內蛋白，并且需要在不依賴數據庫的情況下獲取精確 N 端序列時，Edman 降解依舊是不可替代的“金標準"。

圖1. 埃德曼測序流程

埃德曼測序的優勢

Edman 降解原理的核心在于化學專一性與循環效率。苯異硫氰酸酯對游離氨基具有jí gāo親核反應活性，而對肽鏈側鏈幾乎無親和力，從而保證了反應位點dú yī wú èr；PTC-肽在極性有機溶劑中的可溶性則避免了固液相交錯帶來的擴散壁壘；酸解生成的 ATZ-氨基酸因其雙環結構具備穩定并可 UV 檢測的共軛體系，使得每輪檢測既快速又靈敏。通過樣品的固相固定（PVDF 膜或玻璃纖維濾片）與全自動循環反應器相結合，現代儀器可在 1–2 h 內完成 10–15 個氨基酸殘基的識別，極大提高了高通量驗證需求的響應速度。對藥物研究而言，Edman 測序經常被用來確認抗體輕鏈或重鏈的 N 端序列，以及重組蛋白藥物在上游表達或下游精制過程中是否發生 N 端部分截短；在疾病機制研究中，炎癥相關蛋白或信號肽的剪切位點可通過 Edman 精確定位，從而為靶向抑制劑設計提供直接坐標。

埃德曼測序的不足

然而，Edman 測序也存在固有局限。首先，樣品必須具備游離且未被翻譯后修飾（PTM）遮蔽的 N 端 α-氨基；乙酰化、甲酰化或環化（如吡咯啉）都會阻斷 PITC 縮合反應，導致循環無法啟動。其次，含有多硫鍵、酸不穩定修飾或罕見氨基酸（如賽果氨酸）時，酸解步驟可能引發副反應并降低讀序正確率；羥脯氨酸等修飾殘基缺乏穩定衍生體，也會增加鑒定難度。再次，由于每一循環存在約 1–2 % 的衍生和裂解損失，理論最大讀長通常受限于 40–60 個殘基，遠低于質譜測序可同時解析上百殘基肽段的能力；若樣本是混合物或存在 N 端裂解微雜，Edman 更難在單次讀取中解析多序列重疊信號。再者，操作仍需依賴昂貴試劑與專門的自動化儀器，其維護成本和單樣本分析費用在中小規模實驗中可能高于傳統質譜。

百泰派克的解決辦法

針對上述短板，百泰派克通過多策略整合為 Edman 測序注入現代化活力。首先，在樣品準備端引入選擇性脫保護和化學還原策略：通過 N-端脫乙酰化酶或羥胺處理可在溫和條件下解屏蔽 α-氨基，并使用 DTT/TCEP 完整斷開二硫鍵，從根源上提高循環起始效率；對環化起始殘基，則采用酸或酶促開環后再衍生。其次，實驗平臺配備超微量激光切割系統與納升級捕集柱，使從 SDS-PAGE 條帶到固相固定的轉移回收率提升 20 %以上，并顯著降低背景噪聲；對于難溶跨膜片段，團隊使用疏水捕集劑與可逆表面活性劑相結合的方法，在維持蛋白完整性的同時兼顧衍生反應通量。再次，百泰派克在循環檢測后端疊加高分辨 LC-MS 輔助驗證：若衍生氨基酸 UV 峰分辨度不足，質譜將二次確認分子量與碎片指紋，最大限度避免殘基誤判。對于超出 50 殘基的需求，公司提供“Edman-MS 組合策略"——先用 Edman 精確讀取前端 10–15 個殘基確定起始位點，再利用高能 CID/HCD 分段質譜對后續序列進行覆蓋，使整體讀長突破 100 殘基。最后，在數據層面，內置的算法可自動校準循環效率衰減曲線、補償異構氨基酸共洗脫信號，并輸出置信度評分，方便研究者一鍵集成到 LIMS 或 CMC 文件中。

結語

綜上所述，Edman 降解法測序作為最早實現自動化蛋白 N 端解析的化學技術，在現代蛋白質組學與生物制劑質控中仍占據不可替代地位。它以化學專一性高、循環效率穩定、對數據庫零依賴等優勢，為驗證未知蛋白 N 端序列、定位截短/剪切及評估翻譯后修飾遮蔽提供了獨到捷徑；同時，它也受限于起始氨基依賴、讀長有限和反應條件苛刻等缺點。隨著百泰派克將酶促脫保護、納流捕集、質譜耦合及智能演算法多維度整合，新一代 Edman 流程已經能夠在分析通量、準確性與讀長上取得突破，為基礎研究人員與生物制劑開發者提供更加靈活、可靠且經濟的序列驗證服務。借助這套升級方案，科研人員不僅能夠在單條帶、低納摩爾水平迅速獲得起始序列，還可對復雜融合蛋白或跨膜片段進行分段驗證，進一步縮短研發周期、提高結構功能研究的縱深度。

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