盡管蛋白質組學已為我們提供了細胞中蛋白表達的全景圖譜，但僅有蛋白表達量信息，遠不足以解釋生命系統的動態調控行為。蛋白質的功能狀態，并不簡單由其表達水平所決定，而是高度依賴于翻譯后所發生的共價修飾事件，即所謂的翻譯后修飾（Post-Translational Modifications, PTMs）。這些修飾包括酶促或非酶促地將化學基團（如磷酸、乙酰、甲基、泛素等）添加至特定氨基酸殘基，從而調控蛋白質的構象、酶活性、穩定性、亞細胞定位及其與其他生物大分子的相互作用。

當前已有研究表明，超過80%的功能性蛋白質在體內處于某種翻譯后修飾狀態，其中許多修飾具備動態性、可逆性和時空特異性，可在數秒至分鐘的尺度內響應外界刺激。例如，細胞信號轉導過程中激酶和磷酸酶的協同作用，可實現對信號級聯的放大與反饋調控；而泛素-蛋白酶體系統通過多聚泛素鏈型的差異，構建出復雜的降解選擇性和非降解性信號傳導通路。更重要的是，多個修飾往往并非獨立發生，而是呈現“串擾（crosstalk）"關系，通過互作、競爭、協同等模式在蛋白質表面構建出高度復雜的“修飾碼（PTM code）"，對細胞命運決策與功能分化具有深遠影響。

Cell Res 24, 143–160 (2014)

真核細胞中多種可逆和不可逆的蛋白質翻譯后修飾 (PTM) 機制

在系統生物學視角下，PTMs被認為是連接基因型與表型之間的關鍵橋梁，代表了除表達量之外的第四層調控邏輯。其研究不僅為我們揭示細胞信號網絡、表觀遺傳調控與應激應答等過程的精細機制，也為疾病機制解析、藥物靶點篩選與臨床標志物發現提供了關鍵突破口。近年來，新型修飾（如乳酸化、羥丁酰化、谷胱甘肽化等）的陸續發現進一步拓展了我們對代謝-表觀-信號聯通性的理解，表明PTMs是理解生命系統復雜性的核心切入點之一。

常見的翻譯后修飾類型

蛋白質翻譯后修飾（PTMs）涵蓋數百種不同的化學修飾類型，其中一些在進化中高度保守，另一些則僅限于特定生理狀態或特定物種。它們主要發生在蛋白質鏈的側鏈官能團上（尤其是Ser, Thr, Tyr, Lys, Arg, Cys等殘基），通過酶促或非酶促的方式引入小分子基團、多肽或糖鏈等修飾單位。以下列舉并解析幾類在研究和臨床中zuì jù代表性的PTM類型及其作用機制：

1、磷酸化（Phosphorylation）

磷酸化是最為廣泛研究的一種PTM，由蛋白激酶（kinase）催化，將ATP來源的磷酸基團轉移至蛋白質的絲氨酸（Ser）、蘇氨酸（Thr）或酪氨酸（Tyr）殘基上，生成磷酸化肽段。該修飾高度動態，可被磷酸酶（phosphatase）可逆去除，構成一種基于開/關機制的調控系統。

這一修飾主導著絕大多數細胞內信號轉導級聯，如MAPK、PI3K-Akt、JAK-STAT等經典通路中，磷酸化事件驅動激酶活化、轉錄因子核轉位、細胞周期調控等關鍵生物過程。因其反應速度快、放大效應強，磷酸化常被視為最核心的信息傳遞修飾形式。

PLoS One. 2016 May 31;11(5)

MAPK 級聯及其激活機制的示意圖

質譜檢測中，磷酸肽因帶負電荷而需通過IMAC或TiO?進行選擇性富集；而位點定位常依賴于高分辨MS/MS數據中的中性丟失離子（如–98 Da）以及精確的b/y離子匹配。

2、乙酰化

乙酰化（acetylation）最早是在組蛋白上發現，后被證實廣泛存在于非組蛋白蛋白質中。其核心功能在于調節賴氨酸殘基正電荷，從而改變蛋白與DNA、蛋白與蛋白之間的靜電相互作用。對組蛋白而言，這種修飾直接關系到染色質的開放程度和轉錄可及性，是表觀遺傳調控的基本符號。

但近年來，非組蛋白乙酰化逐漸成為研究焦點。在代謝酶、信號轉導分子和結構蛋白中，乙酰化通過影響構象穩定性、酶活性甚至亞細胞定位而參與多層級調控。例如，p53的多位點乙酰化不僅增強其DNA結合能力，還調節其與泛素化系統之間的交叉調控，延長其半衰期，避免異常降解。

此外，乙酰化與能量代謝的連接尤為緊密。細胞內乙酰輔酶A濃度的波動可直接影響乙酰化水平，形成從代謝通量到表觀狀態的耦聯通道。因此，乙酰化已不再只是“轉錄開關"，而是一種“代謝-表觀信息中介"。

在質譜檢測中，乙酰化肽段由于無電荷變化，識別難度大，需借助高親和力的anti-acetyl-Lys抗體富集，常采用Lys-N或Trypsin酶解以保留關鍵修飾位點，定量推薦使用TMT或label-free策略。數據分析中需特別注意與其他修飾（如甲酰化、谷酰化）質量漂移接近所造成的定性混淆。

3、甲基化（Methylation）

與磷酸化或乙酰化不同，甲基化（methylation）并不引起電荷變化，其功能也更偏向于構建“穩定狀態"。組蛋白甲基化是這一類別中研究最深的修飾類型，不同位點和甲基數目（mono-/di-/tri-methylation）對染色質結構與基因表達有著精確調控功能。例如，H3K4me3常作為啟動子激活的標記，而H3K27me3則與沉默區域高度相關。

但甲基化的作用遠不止于組蛋白。諸如轉錄因子、信號蛋白、RNA結合蛋白等非組蛋白甲基化事件，在細胞發育、胚胎分化和干細胞命運決定中逐漸顯露其調控效應。一個值得關注的問題是，許多甲基化位點的生物學功能目前仍屬未知，部分甲基化甚至可能作為“保護性封閉"標志而非功能激活，提示我們對其“功能性解讀"仍處在初級階段。

質譜上，甲基化修飾的質量變化小（+14.0157 Da），需精確區分單/雙/三甲基狀態。且修飾異構體之間譜圖重疊嚴重，通常建議采用高分辨率MS和多重酶切驗證，輔以抗甲基化抗體富集提高特異性。

4、泛素化與類泛素修飾

泛素化（ubiquitination）是指將76個氨基酸組成的小分子蛋白——泛素（ubiquitin）通過異肽鍵（isopeptide bond）共價連接至目標蛋白賴氨酸殘基的過程。泛素化是zuì jù“可塑性"的修飾類型之一。它既可作為蛋白質降解的直接標記，也能通過構建多種鏈型（K48、K63、K11、線性鏈等）參與細胞信號調控、DNA修復、膜轉運乃至轉錄調控等過程。

Apoptosis. 2022 Oct; 27(9-10):668-684

各種類型的泛素連接及相關功能

除泛素外，細胞中還存在一類結構相似、但功能側重不同的“小泛素樣蛋白"（Ubiquitin-like proteins, Ubls），包括：

● SUMO（小泛素相關修飾）：參與轉錄因子調控、DNA修復和核-胞質運輸

● NEDD8：通過修飾Cullin蛋白調節泛素E3連接酶復合體（CRL）的活性

● ISG15：在抗病毒應答中表達上調，影響干擾素信號放大

與大多數小分子修飾不同，泛素為完整蛋白，其在樣品酶解后留下一個典型的二肽殘基（Gly-Gly），位于賴氨酸側鏈上，產生+114.0429 Da的質量偏移。識別這類殘基的關鍵在于：

● 使用K-ε-GG抗體富集特異性肽段

● 結合高分辨質譜（MS/MS）獲得b/y離子精確定位

● 輔以多酶聯合酶解（如Trypsin + Lys-C）提高修飾覆蓋率

5、糖基化

糖基化（glycosylation）是wéi yī以“結構多樣性"為功能基礎的翻譯后修飾類型。與磷酸化、乙酰化這類“功能性單點修飾"不同，糖基化的功能往往依賴于其糖鏈結構、長度、分支與位置的變化。

N-糖基化（Asn）與O-糖基化（Ser/Thr）在細胞表面蛋白、分泌蛋白和受體蛋白中廣泛存在，調節其折疊效率、膜定位、免疫逃逸能力等。例如，PD-L1的N-糖基化增強其穩定性和膜表達，是腫瘤免疫抑制機制的一部分。糖鏈的改變也是腫瘤轉化過程中的重要標志，如Tn抗原（O-GalNAc）在多種癌細胞中表達升高。

糖基化的最大挑戰在于其異質性：同一糖基化位點可能存在數十種不同的糖型（glycoforms），這對檢測與定量帶來巨大壓力。HILIC、PGC等色譜方法結合MSn技術是當前主流策略，但對于復雜糖型解析仍需多平臺數據融合。

此外，糖基化研究高度依賴生物信息學注釋，如GlycoWorkbench、Byonic中集成的糖鏈結構數據庫，在非靶向檢測中更是bù kě huò quē。

6、新型修飾

隨著高分辨率質譜（HR-MS）和靶向富集技術的發展，許多以往難以捕捉的新型翻譯后修飾逐漸進入研究視野。這些修飾通常與代謝物直接相關，具有時間尺度快、調控范圍廣、對環境變化高度敏感的特征，成為連接細胞代謝狀態與表觀遺傳程序之間的關鍵樞紐。以下是當前研究熱點中數種具代表性的新型修飾：

（1）乳酸化（Lactylation）

乳酸化（Kla）（lactylation）是zuì jù代表性的代謝型修飾，最早由Zhang等于2019年在組蛋白H3上發現，是由內源性L-乳酸供體通過酰基轉移機制修飾賴氨酸側鏈的過程。該修飾在缺氧、糖酵解增強（Warburg效應）、免疫應答等背景下顯著上調，已被證實能夠調控巨噬細胞極化（M1→M2）、干細胞命運和癌基因表達等過程。

Trends Biochem Sci. 2020 Mar;45(3):179-182.

組蛋白乳酸化介導基因表達促進M2樣表型

其機制表明乳酸不僅是代謝副產物，更是可直接參與調節染色質活性的信號分子。研究已發現組蛋白以外的非組蛋白靶點（如酶類、轉錄因子）也可發生乳酸化，提示其在轉錄調控與蛋白互作網絡中發揮廣泛功能。

檢測難點：乳酸化肽段的質量偏移（+72.0211 Da）容易與其他修飾混淆，且靶點豐度極低，需結合特異性抗體富集與納升LC-MS/MS檢測。

（2）羥丁酰化（β-Hydroxybutyrylation, Kbhb）

β-羥丁酸（BHB）是饑餓、禁食或酮飲食條件下生成的主要酮體，它可在體內高濃度積累，并作為修飾底物引入賴氨酸側鏈，形成β-羥丁酰化修飾。該修飾在肝臟、肌肉、腦組織中廣泛存在，被認為是能量缺乏狀態下表觀轉錄程控的關鍵標志。

研究發現Kbhb可競爭乙酰化位點，進而抑制炎癥基因表達（如NF-κB靶基因），提升氧化應激耐受性，是長壽、代謝健康等領域的重要關注對象。

技術挑戰：Kbhb修飾的異構體較多，需通過高分辨MS及串聯質譜碎片信息精細鑒定；結合SILAC標記或PRM/targeted MS有助于修飾定量。

（3）谷胱甘肽化（S-glutathionylation）

谷胱甘肽（GSH）是細胞內最主要的抗氧化小分子，其在氧化脅迫狀態下可通過二硫鍵與蛋白質巰基形成混合二硫鍵（S-SG），即S-谷胱甘肽化。該修飾對保護重要酶類免受不可逆氧化、調控酶活性、傳遞ROS信號等具有重要意義。

S-glutathionylation通常發生在Cys殘基上，具有可逆性，可被谷胱甘肽還原酶（GR）或硫氧還蛋白酶（Trx）系統去修飾。

質譜識別要點：修飾質量偏移為+305.0682 Da，因巰基反應活性高，樣品制備需快速低溫處理，避免假陽性。衍生化捕獲策略（如Biotin-GSH）已逐步被用于富集低豐度修飾肽。

（4）乙酰谷氨酰化（Acetylglutarylation）、丙酰化（Propionylation）、丁酰化（Butyrylation）等：線粒體代謝衍生修飾

這些脂肪酸中間體衍生的修飾形式，廣泛發生于線粒體內膜蛋白與代謝酶上。它們反映了細胞脂質代謝活動水平，并通過競爭賴氨酸乙酰化調節轉錄因子活性、染色質狀態與細胞命運。例如，丁酰化已被報道可調控p53依賴性凋亡過程。

這些修飾均存在位點交疊、質量漂移重疊等識別難點，需結合特異富集策略與靶向碎片分析方法聯合鑒定。

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