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經歷凋亡的細胞表現出核形態的變化，包括DNA斷裂、染色質縮合、核被膜降解、核出泡和DNA鏈斷裂。賽默飛提供各種TUNEL試劑盒和DNA染料用于分析這些變化；它們大多數與檢測細胞健康和活性參數的其他試劑和方案兼容。

賽默飛提供用于成像分析的染色質縮合和TUNEL試劑盒，請訪問獲取產品最新信息。

什么是TUNEL試劑盒？

在程序性細胞死亡或凋亡的后期，DNA變得高度斷裂。這種斷裂提供了一個機會，利用末端脫氧核苷酸轉移酶催化的dUTP末端標記(TUNEL)反應，將修飾的dUTP連接到受損DNA的3 ' -OH端。然后，可以使用一系列不同的檢測策略來檢測修飾的dUTP，如BrdUTP或EdUTP。BrdUTP抗體已用于間接檢測，而通過偶聯生物素或熒光修飾的核苷酸（即生物素-dUTP或熒光素-dUTP）可實現直接檢測。“Click點擊化學"反應是目前較新且能提高檢測靈活性的修飾方法。TUNEL檢測已成為廣泛使用的原位檢測細胞凋亡的方法。

在本頁，您可以找到：

· 使用Click點擊化學鏈接的TUNEL試劑

· 用于組織分析的TUNEL試劑

· 分析培養細胞的TUNEL試劑

· DNA染料用于可視化染色質縮合

· TUNEL染色檢測細胞凋亡

使用點擊化學Click的TUNEL試劑盒

Click-iT TUNEL成像檢測試劑盒

傳統上，TUNEL試劑盒使用BrdUTP結合DNA，隨后通過各種方法進行檢測。Thermo Fisher Scientific開發了經改進的TUNEL試劑盒，它使用TdT在斷裂DNA的3’-OH末端引入了炔烴修飾的dUTP、EdUTP（圖1）。在Invitrogen Click-iT TUNEL檢測中，使用Click點擊化學方法檢測這個合并的核苷酸，點擊化學是一種基于銅催化的疊氮化物-炔烴環加成的反應，其高度特異性源于在生物分子、細胞、組織或模型生物中沒有類似的疊氮化物和炔烴反應。可以通過熒光或比色的方法來檢測合并的EdUTP。

圖 1.在Click-iT TUNEL成像檢測試劑盒中提供了Click-iT EdUTP核苷酸結構。

Click-iT TUNEL成像檢測試劑盒的基本步驟如圖2所示。處理樣品后，通過固定和滲透細胞或組織來保存晚期凋亡細胞，從而降低由于細胞分離和后續操作損失而導致的假陰性。然后通過TdT將EdUTP核苷酸快速合并到斷裂DNA中。下一步是偶聯染料或生物素疊氮化物，然后添加復染劑。與一步法摻入染料或生物素修飾的核苷酸相比，對于Click-iT TUNEL成像試劑盒，兩步法可在兩小時或更短時間內的相同條件下檢測到更高比例的凋亡細胞（圖3）。

圖 2.用Click-iT TUNEL成像試劑盒檢測凋亡。

圖 3.比較不同修飾的dUTP檢測凋亡細胞的差異。用0.5μM星形孢菌素處理Hela細胞4小時。細胞固定和破膜后，根據Click-iT EdUTP、BrdUTP和另外2種不同熒光素dUTP產品的說明書進行TUNEL成像檢測。根據陰性對照計算陽性百分比。使用Thermo Fisher Scientific公司的ArrayScan II進行成像和分析。

Click-iT Plus TUNEL成像檢測試劑盒

最初的Click-iT TUNEL成像試劑盒依賴于銅的使用，并且我們發現生物分子對銅濃度表現出不同的敏感性。例如，用于催化鏈接化學反應的高銅濃度會影響熒光蛋白(如GFP)與其他試劑兼容的能力，因為熒光蛋白的熒光會淬滅或使用肌動蛋白特異性化合物鬼筆環肽時表現出結合能力下降。為了克服這些挑戰，我們開發了Click-iT Plus TUNEL試劑盒，經優化的銅濃度使熒光蛋白的信號更穩定且提高與鬼筆環肽結合的兼容性，同時促進檢測反應。

用于組織分析的TUNEL試劑

用于熒光檢測的Click-iT Plus TUNEL試劑

原位凋亡檢測的Invitrogen Click-iT Plus TUNEL檢測試劑盒可適用于組織切片和粘附細胞。熒光檢測試劑盒與GFP或其他熒光蛋白兼容，并可與鬼筆環肽兼容，如圖4所示。Click-iT Plus TUNEL試劑盒具有明亮穩定的熒光信號，可與Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 594或Alexa Fluor 647疊氮化物一起使用。

圖 4.Click-iT Plus TUNEL試劑盒可以與多種其他熒光探針共同使用。用DNase I處理在腸肌中表達GFP的轉基因小鼠福爾馬林固定、石蠟包埋（FFPE）組織，然后用Alexa Fluor 594染料進行Click-iT Plus TUNEL檢測，再用Hoechst 33342染料和Alexa Fluor 647鬼筆環肽染色。（A）用Hoechst 33342染料（藍色）對細胞核染色，（B）在周圍肌肉層中檢測到GFP信號（綠色），（C）絲狀肌動蛋白用Alexa Fluor 647鬼筆環肽（紫色）染色，以及（D）通過Click-iT Plus TUNEL試劑盒標記Alexa Fluor 594染料（紅色）產生的就是TUNEL陽性信號。最后一個圖（E）是四個熒光信號疊加而成的圖像。

用于比色檢測的Click-iT TUNEL試劑盒

Invitrogen Click-iT TUNEL比色法IHC檢測試劑盒已經過優化，通過使用生物素疊氮化物和鏈霉親和素-過氧化物酶偶聯來識別組織中的凋亡細胞，盡管也可以用于粘附細胞。在將EdUTP摻入DNA片段位點后（圖5），用生物素疊氮化物標記EdUTP。隨后添加鏈霉素親和素-過氧化物酶和DAB（過氧化物酶底物），會產生深棕色信號，可通過光學顯微鏡檢測并儲存數據。該檢測也可與其他比色組織染料共同使用（圖6）。

圖5.Click-iT TUNEL比色法IHC檢測試劑盒的檢測工作流程。

圖6.用比色Click-iT TUNEL凋亡檢測試劑盒標記小鼠組織切片。使用DAB標記標記福爾馬林固定、石蠟包埋（FFPE）的8μm小鼠胸腺切片，使用Click-iT TUNEL比色法IHC檢測試劑盒檢測凋亡細胞（暗褐色細胞核）。隨后用曙紅Y（粉紅色）對組織進行染色，然后用甲基綠（藍色）進行核復染、脫水，并硬固定在Thermo Scientific Cytoseal 60固定培養基中。使用EVOS FL自動成像系統獲得明場圖像，20倍物鏡。

分析培養細胞的UNEL試劑盒

Invitrogen Click-iT TUNEL Alexa Fluor成像檢測試劑盒適用于HSC和成像分析培養的細胞。小量特異性標記基使實驗方案變得快速而有效。這個試劑盒用時在2小時內，能高效鑒別細胞群凋亡的細胞。通過選擇熒光標記，Click-iT TUNEL檢測試劑盒能與表面和細胞內標志物檢測同時使用。然而，對于細胞骨架的檢測，我們建議您使用一抗來代替鬼筆環肽（圖7）。我們也不建議與熒光蛋白聯用。我們已經把該試劑盒和各種凋亡誘導試劑（包括星形孢菌素）用HeLa、A549和CHO K1細胞中進行了測試，同時通過抗體檢測凋亡標志物（如裂解的多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（PARP）、剪切的半胱天冬酶-3、磷酸化組氨酸2B）進行了多重檢測。它也被證明可以有效地檢測人MCF-7乳腺癌細胞中siRNA敲低DEC2轉錄因子而引起的凋亡。

圖7.使用Click-iT TUNEL成像檢測試劑盒對晚期凋亡進行檢測。用星形孢菌素處理HeLa細胞，然后固定并破膜。進行Click-iT TUNEL Alexa Fluor 647成像檢測。用激活型caspase-3兔單克隆一抗檢測活化的半胱天冬酶-3，并用Alexa Fluor 488山羊抗兔IgG二抗(綠色)標記。用小鼠單克隆抗微管蛋白抗體檢測微管蛋白，并用Alexa Fluor 555山羊抗小鼠IgG（橙色）二抗標記。細胞核用Hoechst 33342（藍色）染色。淺藍色代表半胱天冬酶（綠色）、Hoechst（藍色）和TUNEL（洋紅色）信號的疊加。

用于染色質縮合可視化的DNA染料

DNA染料為區分凋亡細胞中的縮合提供了最快的途徑。細胞核染色適用于活細胞或固定細胞，我們提供廣泛的波長，更好的與其他標記產品共同使用。ReadyProbes試劑在室溫下穩定，并為方便即用滴管瓶形式的DNA染料。

Click-iT™ TUNEL細胞凋亡實驗試劑盒

初代Click-iT™ TUNEL實驗試劑盒針對細胞培養樣品優化，也可用于組織樣品。我們建議對組織樣品使用Click-iT™ Plus TUNEL for In Situ Apoptosis Detection實驗試劑盒；用于組織的Click-iT™ Plus TUNEL for In Situ Apoptosis Detection實驗試劑盒的實驗方案針對組織樣本優化。通過改進方案可以提高TdT酶進入多層細胞組織樣品的效果。另外，相比于Click-iT™ Plus TUNEL試劑盒，我們發現初代Click-iT™ TUNEL試劑盒可能會在組織樣品出現高度非特異性結合和點狀染色。有一個增加組織透過性較好的方法是用蛋白酶K消化然后甲醛中再固定樣品以取代去污劑透化作用步驟。Click-iT™ Plus TUNEL試劑盒手冊第三部分的組織固定和透化作用方案可用于初代Click-iT™ TUNEL實驗處理組織樣品。胃蛋白酶和其他的蛋白水解酶同時也可用于提高組織透過性。

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